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一、研究背景和目的肠出血型大肠埃希菌（enterohaemorrhagic E.coli,EHEC）O157:H7是一种新型肠道致病菌,能引起人出血性肠炎（hemorrhagic colitis,HC）、溶血性尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome,HUS）和血栓性血小板减少性紫癜（thromboticthromobocytopenie porpura,TTP）等。EHEC O157:H7感染呈暴发流行趋势,具有高度的致病性与致死性,已成为全球性公共卫生问题。目前,尚缺乏有效的防治方法,使用抗生素治疗可促使大肠埃希菌O157:H7释放致死性志贺毒素（Shiga toxin,Stx）,加剧患者并发HUS的危险性。可见,研制出安全、有效的疫苗对预防EHEC O157:H7感染具有重要意义。迄今为止,尚无成功的疫苗用于临床。EHEC O157:H7的毒力因子主要有转位紧密黏附素受体（translocationimimin receptor,Tir）、紧密黏附素（Intimin）、志贺毒素1型、2型（StX 1、Stx 2）和溶血素（Haemolysin,Hly）等。转位紧密黏附素受体（Tir）经细菌Ⅲ型分泌系统转位进入宿主细胞并定位于细胞膜上,与紧密黏附素结合后,可引起宿主细胞多聚肌动蛋白聚合,造成黏附局部微绒毛刷状缘破坏,形成特征性的黏附和抹平损伤（attaching and effacing lesion,A/E lesion）。因此,阻断紧密黏附素与Tir的结合,可避免黏附和擦拭性损伤的发生,在感染的黏附阶段予以拮抗。本研究从NCBI网站GenBank上查到EHEC O157:H7标准株EDL933转位紧密黏附素受体完整的编码区（cds）基因序列（Accession number NC 002655.2）和氨基酸序列（protein id NP290261.1）。利用生物信息学在线工具和软件,预测分析其蛋白结构和功能特性,判断能否作为疫苗候选抗原;设计特异性引物,扩增Tir编码基因;将PCR产物克隆到pET-30a（+）载体上,获得重组原核表达质粒[pET-30a（+）-tir];转化至大肠埃希菌BL21/DE3,诱导表达和纯化重组蛋白Tir;将重组蛋白Tir免疫小鼠,检测血清和粪便提取物中抗体效价,对重组蛋白Tir的动物免疫保护作用进行了初步研究。二、研究方法1-EHEC O157:H7 Tir基因的生物信息学分析从NCBI网站GenBank上查到EHEC O157:H7标准株EDL933 Tir完整的编码区基因序列和氨基酸序列。运用在线网络服务器蛋白分析专家系统Expasy（http://ca.expasy.org/）所提供的蛋白组学和序列分析工具,预测Tir的理化性质,如分子量、等电点、一级结构和二级结构等;利用服务器http://www.cbs.dtu.dk,使用Phobius工具预测Tir的跨膜螺旋所在区域;使用B细胞表位在线分析软件（http://tools.immuneepitope.org.tools）预测蛋白质的B细胞表位。2.EHEC O157:H7 Tir基因的克隆、表达和鉴定2.1 Tit基因的扩增和克隆根据目的基因的ORF和原核表达质粒PET-30a（+）酶切位点,设计2条引物,PCR扩增tir基因,限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切PCR产物和空质粒PET-30a（+）,T4连接酶连接。用PCR、双酶切及测序鉴定重组质粒。2.2 Tir基因的表达、纯化和鉴定将重组质粒PET-30a（+）-tir转化至BL21/DE3中,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达重组蛋白Tir,用12%SDS-PAGE鉴定,用亲和层析纯化蛋白。抗6×His单克隆抗体稀释液为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG稀释液为二抗,通过Western Blotting方法,鉴定重组蛋白的免疫反应性。2.3动物免疫和EHEC O157:H7 Tir基因的抗体效价测定重组蛋白Tir与弗氏完全佐剂（第二、三次用弗氏不完全佐剂）或霍乱毒素B亚单位（Cholera toxin B subunit,CTB）混合后,通过皮下和鼻腔两种途径免疫小鼠,对照组用PBS免疫,每间隔2周加强免疫一次。免疫前及免疫3次后10d每组随机抽10只小鼠,从小鼠眼眶采集血清和收集粪便,间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价和粪便提取物中抗体效价。3.小鼠攻毒实验末次免疫20 d后,以EHEC O157:H7活菌进行动物攻毒实验,小鼠于攻毒前禁食、禁水12h,每只小鼠经食道灌注1×1010CFU/ml EHEC O157:H7活菌0.3ml,同时腹腔注射丝裂霉素（2.5 mg/ml）。攻毒后12h恢复饮食饮水,并记录动物死亡情况。15d后,存活的小鼠处死剖检,病理切片观察。三、结果1-EHEC O157:H7 Tir基因的生物信息学分析tir基因全长1,677bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,编码558个氨基酸。理论相对分子质量和等电点分别是58022.4Da和5.01。在溶液中性质稳定,蛋白质总体亲水性高。InterProScan分析该氨基酸序列含有三个结构和功能域,即Tir的N端、C端和与Intimin结合的M区。Sec（secondary structure）预测α螺旋（H）、β折叠（E）和无规卷曲（L）的比例分别是22.76:17.38:59.86,二级结构以无规卷曲为主。Phobius预测结果显示,Tir蛋白有2段跨膜结构,2个肽段在细胞质内,1个肽段在细胞膜外。Bepipred分析预测有20个B细胞线性表位肽段。2.EHEC O157:H7 Tir基因的克隆、表达和鉴定用设计合成的引物扩增出tir基因,经琼脂糖凝胶电泳检测显示,大小为1,677bp,与预期一致。重组质粒pET-30a（+）.咖经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切和测序鉴定,证实构建成功。重组质粒在IPTG诱导下表达重组蛋白,经SDS-PAGE电泳显示与理论预测的融合蛋白分子量相符,亲和层析纯化后获得目的蛋白Tir。Western Blotting鉴定结果显示,空载体pET-30a（+）诱导表达产物不与抗6×His单克隆抗体反应,而纯化的融合蛋白和pET-30a（+）-tir重组菌株IPTG诱导产物在60kD左右处均出现1条特异条带,证明目的蛋白融合了6×His标签,大小与预测的融合蛋白分子量相符。3.EHEC O157:H7 Tir抗体效价测定皮下免疫和鼻腔免疫后,小鼠血清中均能检测到高滴度的IgG类抗体;皮下免疫组的血清滴度达到6400,鼻腔免疫组为3200;鼻腔免疫组血清获得的IgA类抗体滴度为6400,明显高于皮下免疫组（200）。鼻腔免疫组粪便提取物sIgA类抗体滴度为16,也高于皮下免疫组（4）。4.动物攻毒实验在15d观察期内,皮下对照组和鼻腔对照组死亡7只,存活7只,存活率为50%。皮下免疫组死亡5只,存活9只,存活率为64.3%（9/14）。鼻腔免疫组死亡1只,存活13只,存活率为92.9%（13/14）。经x2检验分析,鼻腔免疫组与其对照组有显著性差异（P=0.033）;皮下免疫组与其对照组无统计学差异（P=0.704）。四、结论扩增的tir基因大小为1,677bp,为完整的编码区基因序列,编码蛋白Tir相对分子质量和等电点分别是58022.4Da和5.01,在溶液中性质稳定,蛋白质总体亲水性较高,含有2段跨膜结构和3个功能域。预测结果显示,Tir毒力因子是很有潜力的疫苗候选抗原。成功构建了pET-30a（+）-tir原核表达载体,细菌培养物经IPTG诱导表达出重组融合蛋白,纯化得到重组融合蛋白,分子量大小为60KD左右。重组蛋白通过皮下和鼻腔两种途径免疫小鼠后,均可刺激小鼠产生特异性IgG和IgA类抗体,在粪便提取物中也能检测到IgA类抗体。皮下免疫组的血清IgG类抗体滴度高于鼻腔免疫组;鼻腔免疫组获得的IgA类抗体滴度明显高于皮下免疫组;鼻腔免疫组粪便提取物IgA类抗体滴度亦高于皮下免疫组。对小鼠进行半数致死量EHEC O157:H7活菌攻毒后,皮下免疫组产生的免疫保护作用小,鼻腔免疫组可产生显著的免疫保护作用。综上所述,Tir是具有良好应用前景的EHEC O157:H7疫苗的候选抗原。