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背景肌腱病是一组由于过度使用导致的肌肉骨骼疾病的总称,发病率约为2%~65%,占所有运动相关疾病的30%~50%,逐渐成为影响人类运动能力和生活质量的主要疾病之一。目前,关于肌腱病的治疗方法没有统一的标准,治疗效果不甚满意,复发率高,根本原因在于肌腱病的发病机制尚未确切,导致治疗上缺乏针对性。随着研究工作的深入,神经性炎症在肌腱病发病机制中的作用日益受到关注。P物质(Substance P,SP)是一种重要的促炎症反应的介质,参与痛觉传递和加剧神经源性炎症反应。有研究发现,肌腱病组织中SP及其受体NK-1R表达升高,肌腱病变及临床症状与SP阳性的神经纤维增多相关,并且SP能促进肌腱组织增生、胶原重塑、肌腱细胞增殖并加速肌腱的无菌性反应;同时,SP还是具有机械反应性的炎症介质,肌腱细胞在体外机械牵伸的条件下分泌SP;SP还可影响干细胞的分化,如促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化。肌腱干细胞(TSCs)作为肌腱细胞的唯一前体细胞,具有较强的增殖和分化能力,TSCs的分化命运是决定肌腱微损伤修复成功与否的关键因素之一。TSCs的分化受各种机械和生化因素的影响。适度机械牵伸(4%)可诱导TSCs正常分化为肌腱细胞,促进损伤的自我修复;过度机械牵伸(8%)可诱导TSCs异常分化为成脂肪、成软骨和成骨细胞,促进肌腱病形成。已有研究发现机械牵伸可刺激TSCs分泌炎症介质,而且某些炎症介质也可影响TSCs的增殖和分化,为阐明肌腱病的发病机制提供了新的思路。回顾文献,有关SP对TSCs增殖和多向分化的作用还未见报道。目的本研究的主要目的包括观察临床肌腱病标本的SP表达情况与病理学特征;利用离体细胞模型明确过度牵伸对TSCs分泌SP的作用、SP对TSCs增殖和分化的影响;利用在体动物模型观察外源性SP在肌腱病形成中的作用。材料与方法1.肌腱病SP表达与病理学特征观察2013年5月至2014年4月在我院行关节镜手术的患者,分为两组。腱病组:关节镜证实为肩袖腱病的的患者,取冈上肌腱标本,共15例;对照组:行关节镜下肩关节稳定手术的患者,取肩胛下肌腱标本,共8例。用免疫荧光染色检测临床标本的SP表达,并进行半定量的统计学分析;人肩袖腱病组织的组织学评估,包括H-E染色、Masson染色观察以及组织病理学评分。2.过度机械牵伸对TSCs分化和SP表达的影响TSCs的分离培养与鉴定。观察TSCs的细胞形态和克隆形成能力;免疫荧光检测干细胞标志物(Nanog,Nucleostemin和Oct-4)和SP及其受体NK-1R的表达;流式细胞术对细胞的表面标志抗原进行检测,包括CD31、CD34、CD44和CD90;为验证TSCs的多向分化能力,分别对TSCs进行成骨、成脂肪和成软骨诱导分化。利用我们课题组前期自行设计制作的新型体外细胞机械牵伸模型,对TSCs进行机械牵伸(8%,1HZ);用RT-PCR检测其SP及其受体NK-1R的基因表达情况;用Western-Blot和ELISA法检测SP及其受体NK-1R的蛋白表达水平。加入NK-1R拮抗剂(5×10-6M)后,对TSCs进行机械牵伸;用RT-PCR检测TSCs的多向分化基因表达情况。3.SP对TSCs增殖、凋亡和异常分化的影响CCK-8检测不同浓度SP对TSCs增殖的影响;(对照组、10-6M的SP组、10-7M的SP组、10-8M的SP组、10-9M的SP组和10-10M的SP组)CCK-8检测SP和NK-1R拮抗剂对TSCs增殖的影响;结晶紫染色检测SP和NK-1R拮抗剂对TSCs活力的影响;细胞爬片Ki67免疫荧光检测SP和NK-1R拮抗剂对TSCs增殖的影响;流式细胞学检测SP和NK-1R拮抗剂对TSCs凋亡的影响。(对照组、5×10-6M的NK-1R拮抗剂+10-6M的SP组、10-6M的SP组)RT-PCR和免疫荧光检测(10-6M)SP对TSCs的干性的影响;多向诱导分化检测(10-6M)SP对TSCs的分化的影响;RT-PCR检测SP和NK-1R拮抗剂对TSCs分化相关基因的表达的影响;免疫荧光检测SP和NK-1R拮抗剂对TSCs分化相关蛋白的表达的影响。(对照组、5×10-6M的NK-1R拮抗剂+10-6M的SP组、10-6M的SP组)4.外源性SP对大鼠肌腱病形成的作用将36只SD大鼠随机分为三组,即对照组(生理盐水)、低剂量SP组(0.5×10-6M)和高剂量SP组(5×10-6M)。每组12只。分别于14天和28天各处死18只大鼠(每组6只),取跟腱标本。大鼠肌腱标本的组织学检测,包括H-E染色、Masson染色观察以及组织学评分;免疫荧光检测肌腱成脂肪、成软骨和成骨相关蛋白表达情况。结果1.免疫荧光检测结果显示,肌腱病组和对照组的SP和NK-1R均有表达,肌腱病组的SP阳性面积百分比显著大于对照组(P﹤0.05)。组织学评分结果显示,肌腱病组的组织学评分显著高于对照组(P﹤0.05)。肌腱病组的胶原纤维结构破坏,排列紊乱、卷曲,组织增生,细胞明显增多,细胞核变性、碎裂,新生血管形成,甚至可见脂肪样变和玻璃样变等。2.过度机械牵伸导致TSCs的SP基因和蛋白水平表达显著升高(P<0.05)。过度机械牵伸导致TSCs的非肌腱细胞相关基因表达明显增高,如Runx2(成骨细胞标志),PPARγ(成脂肪细胞标志),Sox9和Collagen type II(成软骨细胞标志)(P<0.05),加入NK-1R拮抗剂组的PPARγ,Sox9和Collagen type II的表达较牵伸组显著降低(P<0.05)。3.CCK-8结果显示SP促进了TSCs增殖,并且剂量和时间依赖性的;结晶紫染色结果显示SP增加了TSCs的细胞活力;流式细胞学检测结果显示SP抑制了TSCs的凋亡。SP对TSCs增殖和凋亡的作用可有效地被NK-1R拮抗剂所抑制。SP降低了TSCs的干性。RT-PCR结果显示,SP组的干细胞相关基因Nanog和Nuclestemin的表达均显著低于对照组(P<0.05);免疫荧光检测结果显示,SP组的Nanog和Nuclestemin染色的阳性细胞数均显著低于对照组(P<0.05)。SP促进TSCs成脂肪和成软骨分化。RT-PCR结果显示,SP组的成脂肪(PPARγ)和成软骨(ColⅡ,Sox9)基因表达均显著高于对照组(P<0.05),成骨(Runx2)基因表达差异不显著(P>0.05),而成肌腱的标志基因(TNC,Tnmd)则显著减低(P<0.05);SP+NK-1R拮抗剂组的成脂肪(PPARγ)和成软骨(ColⅡ,Sox9)基因表达显著的低于SP组(P<0.05);而SP+NK-1R拮抗剂组与对照组的相关基因表达无统计学差异(P>0.05)。免疫荧光染色检测结果进一步证实了上述结果。4.组织学评分结果显示,高剂量SP组的总评分显著高于低剂量SP组和对照组(P﹤0.05),而低剂量SP组与对照组差异不显著(P>0.05);免疫荧光结果显示,高剂量SP组的PPARγ和ColⅡ表达均显著高于低剂量SP组和对照组(P﹤0.05);低剂量SP组的PPARγ、ColⅡ和Runx2的表达较对照组差异不显著(P>0.05)。结论1.证实了肌腱病组和正常组都可表达SP,但肌腱病组织中SP表达更强烈;验证了肩袖腱病的病理学特征符合肌腱病的普遍组织病理学表现,如胶原纤维结构破坏、排列紊乱、组织增生、细胞增多、新生血管形成、脂肪样变和玻璃样变等。2.过度机械牵伸可刺激TSCs分泌SP;过度机械牵伸可促进TSCs异常分化;NK-1R拮抗剂可有效抑制过度牵伸导致的TSCs成脂肪和成软骨分化。3.SP通过其受体NK-1R刺激TSCs增殖和抑制TSCs凋亡,可能通过促进肌腱组织增生和细胞增多而加快肌腱病的形成;SP通过其受体NK-1R促进TSCs成脂肪和成软骨分化,可能通过促进脂肪变性和软骨化对肌腱病的形成起促进作用。4.外源性SP促进大鼠肌腱组织增生、细胞增多、新生血管形成和胶原紊乱并导致脂肪化和软骨化等肌腱病形成的作用呈剂量依赖性,即低剂量SP促肌腱病形成的作用不明显,而高剂量SP促进肌腱病形成。SP促进TSCs增殖和异常分化可能是在肌腱病形成中起重要作用。