论文部分内容阅读
竹黄菌为我国传统重要的药用真菌,其活性产物为竹红菌素,该物质能被激发产生活性氧,损伤细胞大分子物质,诱发细胞凋亡。因此,竹红菌素常被作为光敏剂,应用于食品、农业、医药等领域。鉴于其重要应用前景和理论研究价值,国内外专家近几十年来分别对竹红菌素进行了产量优化、纯化、应用等方面的研究。目前,仍缺乏有效的竹黄菌分子操作手段,致使竹红菌素的合成机制研究甚少。此外,在高产竹红菌素的条件下,该菌仍能抵御氧化胁迫,维持良好的生理形态,但其抗氧化网络系统,仍未见系统的报道。本课题以竹黄菌Shiraia sp.SUPER-H168为出发菌株,建立了该宿主基因相对表达分析平台、表达与敲除系统,探讨了参与竹红菌素合成的关键性基因,解析了竹黄菌抵御外界环境及自身毒性产物的抗氧化系统,主要结论如下。（1）构建了稳定的竹黄菌基因相对表达分析平台在竹红菌素生产与缺失的2种培养条件下,分析竹黄菌9个内参基因稳定性及表达丰度。这些内参基因包括肌动蛋白（actin,Act）,柠檬酸合成酶A（citrate synthase A,CsA）,柠檬酸合成酶B（citrate synthase B,CsB）,细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase,CyO）,磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase,PhoK）,丙酮酸脱羧酶（pyruvate decarboxylase,PyrD）,微管蛋白（tubulin,Tub）,18S核糖体RNA（18S ribosomal RNA,18S rRNA）与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）等基因。GerNorm输出结果显示:Tub与Act基因稳定性较弱,不适宜于后期基因相对表达水平分析,CyO与GAPDH稳定性较好,NormFinder软件得出类似的结果。随后,运用GeNorm分析备选内参基因的成对变异值(Vn/n+1),确定最优的内参基因组合。其中,V2/3值为0.119,小于阈值0.15。基于CyO与GAPDH内参基因为稳定性最好的2个内参基因,因此,确定用该组合内参基因的几何平均数归化竹黄菌其余基因的相对表达水平。以竹红菌素合成相关的聚酮合酶为目标基因,确定该方法归化基因相对表达水平可靠性较好,可将该方法用于竹黄菌其余基因相对表达水平分析。（2）建立了竹黄菌表达系统以山梨醇为稳渗剂,萌发的竹黄菌孢子为出发材料,裂解酶、β-葡萄糖醛酸酶、崩溃酶等为破壁酶,得到高质量的竹黄菌原生质体。用聚乙二醇/CaCl2转化法,转化表达质粒至原生质体,在潮霉素抗性平板上,筛选出阳性克隆子。含过表达质粒的竹黄菌呈现出绿色荧光蛋白信号,在野生竹黄菌中未检测到此荧光蛋白信号。运用GAPDH启动子启动绿色荧光蛋白,根据荧光蛋白信号强弱,筛选合适的GAPDH启动子长度。其中,约为2000 bp的GAPDH启动子呈现出较强的荧光信号,可用于后期竹黄菌基因的表达。（3）建立了竹黄菌CRISPR敲除系统野生型竹黄菌与不同CRISPR质粒的竹黄菌（含Cas9质粒、sgRNA质粒）的菌落形态、生物量及竹红菌素色素产量无明显差异,CRISPR元件对竹黄菌无毒性,可用于后期基因编辑研究。选取竹红菌素全局调控的转录因子为靶向基因,建立竹黄菌敲除系统。为提高敲除效率,制备了同源臂序列,并与敲除质粒共转化至原生质体,敲除效率提高至23.07%。随后,进一步优化竹黄菌内源性U6启动子,启动sgRNA序列。其中,采用竹黄菌U6-1与U6-3启动子时,敲除效率略微提升,分别为27.27%与33.33%;采用竹黄菌U6-2启动子时,敲除效率为20%。（4）探究竹红菌素合成的关键性基因运用antiSMASH生物信息学软件预测出竹红菌素合成相关的关键性基因,采用基因相对表达水平工具初步验证聚酮合成酶、单加氧化酶、转录因子等基因相对表达水平与竹红菌素合成呈正相关。运用CRISPR系统敲除这3个基因,敲除菌株均不再生产竹红菌素。相对于野生型菌株,在这3种敲除菌株中,参与竹红菌素代谢途径基因的相对表达水平均显著降低。此外,竹红菌素代谢途径的多铜氧化酶过表达后,该漆酶基因表达量增加了近5倍,该代谢途径聚酮合酶、单加氧化酶等基因的相对表达量增加了7倍以上,基因簇调控因子转录因子提高了9.69倍。多个竹红菌素合成基因的表达量提高,保证了竹红菌素产量提高到3.18 g·L-1,相对于野生型菌株,产量提高了5倍。（5）解析了竹黄菌的抗氧化系统经氧化胁迫的刺激,竹黄菌中超氧化物歧化酶酶活迅速增强,保证过多的超氧自由基转化为无毒性的H2O。过氧化氢酶产量也显著提高,在72 h后,仍处于较高的水平,保证过多的H2O2转化为无毒性的H2O。高浓度的H2O2处理初期,竹黄菌谷胱甘肽过氧化物酶的酶活减少,48 h后,含量迅速提高,促使H2O2转化为无毒性H2O。经H2O2诱导,处理组竹黄菌中还原性谷胱甘肽含量明显增强,即使96 h后,GSH含量也维持在较高的水平。GSH与竹黄菌谷胱甘肽过氧化物酶协同作用,将外源的H2O2迅速催化为H2O。此外,经基因敲除与回补实验确认,竹红菌素合成途径中的转运蛋白（major facilitator superfamily,MSF transporter）将竹红菌素转运至胞外,减少竹红菌素产生的氧化压力。综上所述,竹红菌素来源的氧化胁迫可刺激竹黄菌抗氧化系统,使其维持正常的氧化还原水平,保证该物质连续合成。