背景：　　 近年来，我国肺癌的发病率和死亡率一直呈上升趋势，每年新发病人大约有50万例，并以年5%的速度递增，其中75%-80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancerNSCLC)，总的5年生存率不到15%。而伴有远处转移的晚期NSCLC，自然病程的中位生存期只有4-5个月，1年生存期不足10%。以手术、化疗和放疗为主的传统治疗方法已进入一个瓶颈期，而分子靶向治疗正逐渐成为晚期NSCLC的重要手段。许多大型临床试验表明，以表皮生长因子受体的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)为代表的分子靶向治疗可延长患者的生存期，但EGFR-TKI的疗效与EGFR/KRAS基因的状态密切相关。其中EGFR的18、19、21外显子突变及20外显子T790M突变分别是EGFR-TKI的敏感和耐药指标，KRAS基因突变则是EGFR-TKI的耐药指标。因此，在接受TKI治疗前进行EGFR/KRAS基因状态检测对指导靶向治疗非常重要。目前，NSCLC分子靶点EGFR/KRAS基因检测多为手术切除的肿瘤组织标本。然而，临床上，常常遇到无法获得肿瘤组织标本的情况，EGFR/KRAS基因检测成为困难，严重限制了NSCLC患者的分子靶向治疗选择。因此，探索组织标本的良好替代物及其检测方法，在NSCLC临床诊治中势在必行，具有非常重要的临床意义。　　 目的：　　 本研究旨在通过对伴有胸腔积液的NSCLC患者进行胸水EGFR/KRAS基因检测，建立非组织来源EGFR/KRAS检测的替代方法，并探讨胸水EGFR/KRAS突变状态的临床意义，证实EGFR/KRAS基因突变与临床靶向治疗疗效的关系，为分子靶向治疗疗效预测提供实验依据。　　 方法：　　 本研究通过我院伦理委员会批准，所有患者均已签署知情同意书。收集我科2011年3月至2012年3月符合纳入标准的NSCLC(Ⅳ期，UICC，2009版)，NSCLC合并胸腔积液的胸水标本共63例，NSCLC病理组织样本64例，其中与胸水相互配对的组织标本24例。用QIAGEN公司的体液及组织DNA提取试剂盒对上述标本进行DNA提取，用焦磷酸测序仪对全部63例胸水标本及64例组织标本的EGFR/KRAS突变状态进行检测分析。另随机选取其中30例胸水标本用锁核酸PCR桑格测序法(Locked　　 Nucleic Acids probes Polymerase Chain Reaction LNA-PCR-Sanger)检测KRAS基因状态，与焦磷酸测序进行对比，分析不同检测方法的敏感性。　　 采用卡方检验法比较不同检测方法的检测结果一致性、不同来源的标本EGFR/KRAS突变的一致性；比较EGFR/KRAS突变状态与患者性别、年龄、吸烟史、病理类型的关系；建立入组标准和排除标准，对接受靶向治疗患者进行分析，观察EGFR/KRAS基因状态与TKI疗效的关系。　　 结果：　　 1.胸腔积液EGFR基因突变的焦磷酸测序检测　　 焦磷酸测序法在63例胸腔积液样本中检测出EGFR突变19例(30.16%)，全部为EGFR19/21外显子突变，其中EGFR19缺失突变10例(总突变的52.63%)，EGFR21外显子L858R突变9例(总突变的47.37％)。　　 2.胸腔积液KRAS基因突变的焦磷酸测序和LNA-PCR-Sanger检测　　 焦磷酸测序在63例胸水样本中检测出KRAS突变率为7.93％(5/63)。12号密码子4例，均为GGT>GAT突变，p.G12D c.35G>A，1例13号密码子GGC>GAC突变，p.G13Dc.38G>A，12号密码子突变率占总突变的80%。而LNA-PCR-Sanger法测序，检测的30例胸水样中KRAS突变为6例，突变率为20%(6/30)，其中12号密码子突变4例，3例为GGT>GAT突变，p.G12D c.35G>A，1例为GGT>TGT突变，p.G12C c.34G>T，另2例为第14号密码子GTA>ATA，12号密码子突变占总突变的66.67％。LNA-PCR-Sanger法测序检测出KRAS突变的阳性高于焦磷酸法，但P=0.093，无统计学意义。同时进行焦磷酸测序和LNA-PCR-Sanger检测的样本共30例，焦磷酸测序检出KRAS突变为3例，全部为12号密码子突变，GGT>GAT突变，p.G12D c.35G>A，突变率10.00％(3/33)，与LNA-PCR-Sanger检测法结果比较，P=0.470，也无统计学意义。　　 3.肿瘤组织的EGFR/KARS基因突变检测及与胸腔积液检测结果的比较　　 利用焦磷酸测序对64例NSCLC组织样本进行检测，EGFR基因突变率为34.38%(22/64)，与胸腔积液EGFR突变检检出率30.16%(19/63)比较，无统计学意义(P=0.705)。　　 其中配对的组织和胸腔积液样本24例EGFR突变率分别为37.50％(9/24)和33.33%(8/24)，P=0.500，无统计学意义。　　 利用焦磷酸测序对64例组织样本进行检测，KRAS基因突变率为4.69%(3/64)，12号密码子突变2例，占66.7%，13号密码子突变1例，占33.3％。与胸腔积液KRAS突变检检出率(7.93%，5/63)比较，无统计学意义(P=0.350)。　　 其中配对的组织和胸腔积液样本24例KRAS突变率分别为12.5％(3/24)和8.33％(2/24)，P=0.500，无统计学意义。　　 4.EGFR基因检测与临床相关指标分析　　 组织样本和胸水标本EGFR基因突变与吸烟史(组织P=0.013，胸水P=0.014)、病理组织学类型(组织P=0.022，胸水P=0，020)相关，非吸烟者、肺腺癌患者更易发生EGFR基因突变。用RECIST标准，对接受TKI靶向治疗的18例患者进行了疗效评价，其中EGFR敏感性突变(19外显子缺失突变和21外显子L858R)共5例，TKI治疗后无CR，PR5例，缓解率RR(CR+PR)为100%；EGFR野生型共13例，TKI治疗后无CR，PR为5例，SD3例，PD5例，缓解率RR(CR+PR)为38.5%。与EGFR野生型患者相比，EGFR敏感性突变患者对TKI临床疗效更加敏感，二者有显著的统计学差异(P=0.029)。　　 5.KRAS基因检测与临床相关指标分析　　 组织样本和胸水标本KRAS基因突变与患者的性别、年龄、病例组织学类型、吸烟史等临床病理特征均无明显统计学差异(P>0.05)。用RECIST标准，对接受TKI靶向治疗的18例患者进行了疗效评价，其中KRAS基因突变共1例，达到PR，缓解率RR(CR+PR)为100%；KRAS野生型患者共17例，TKI治疗后无CR，达到PR为9例，SD3例，PD5例，缓解率RR(CR+PR)为56.25%。KRAS基因突变与TKI疗效无明显关系(P=0.556)。该结果与KRAS突变为TKI原发性耐药的西方文献报道有所不同，表明KRAS突变与否与TKI临床疗效相关性可能存在地区差异，需要更大样本的进一步证实。　　 结论：　　 1.在无法获取组织标本的情况下，胸腔积液可成为NSCLC患者的EGFR/KRAS检测良好的替代。　　 2.焦磷酸测序可作为EGFR基因突变的检测方法；LNA-PCR-Sanger测序和焦磷酸测序法均可作为胸腔积液的KRAS突变检测，前者更为敏感。　　 3.与EGFR野生型相比，EGFR基因19、21外显子突变对TKI治疗更敏感。　　 4.LNA-PCR-Sanger法检测出KRAS突变阳性率高于文献报道，KRAS突变与否与TKI临床疗效无明显关系，与文献报道的KRAS突变为耐药性突变的研究结果有所不同，显示KRAS突变率及与TKI临床疗效相关性可能存在地区差异，需要更大样本的研究。