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癫痫(epilepsy)是最常见的神经系统疾病之一,给社会、家庭和个人都带来了沉重的负担。全球约有3500万,我国约900万患者正在遭受该疾病的困扰,其中约25%为难治性癫痫。颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy, TLE)是最常见的难治性癫痫,其发病机制目前尚未完全清楚,药物及手术治疗均难以取得明显的疗效。氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠行为学和海马神经元损伤的病理学改变均与人类颞叶癫痫相似,因此是目前研究癫痫持续状态(status epilepticus, SE)和TLE的常用模型。SE是癫痫的严重状态,是指持续性痫性发作超过30分钟,或者两次或两次以上的相继的痫性发作,期间意识状态未能完全恢复正常。SE可造成海马等结构的神经元选择性死亡,这种选择性神经元死亡能促进癫痫的形成和进展,鉴于癫痫病因及发病机制的复杂性,探索新的神经保护药物及其潜在的作用机制是目前癫痫研究的热点。线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel, mitoKATP通道)在心肌和脑的缺血预适应中被报道过。MitoKATP通道在脑中的含量至少比心肌细胞中数量高6倍,说明mitoKATP通道在中枢神经系统中可能起重要的作用。ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel, KATP通道)有很多的生理功能,其开放／关闭取决于ATP/ADP比率。当ATP含量减少时,KATP通道开放,K+流出细胞使细胞超极化。近来,KATP通道被发现可抑制癫痫发作和谷氨酸等兴奋性神经递质释放。二氮嗪(diazoxide, DZ),一种mitoKATP通道选择性开放剂,能保护癫痫发作引起的神经元损伤,而分子机制未阐明。研究证实mitoKATP通道的保护机制可能包括几个方面,包括Bcl-2依赖机制,抑制线粒体渗透性转运孔等。然而,mitoKATP通道激活发挥细胞保护的具体机制尚未明确。二氮嗪具有的抗凋亡及神经保护作用已被广泛认可,但其是否能在氯化锂-匹鲁卡品致痫引起的海马神经元损伤中发挥保护作用目前研究的很少,其可能的作用机制还未知。为此,本课题建立氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠模型,探讨癫痫发作后海马神经元损伤的病理学特征；检测匹鲁卡品致痫后,给予二氮嗪后,给予二氮嗪和mitoKATP通道抑制剂5-羟葵酸(5-hydroxydecanoic acid,5-HD)后,以及二氮嗪和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)抑制剂渥曼青霉素(wortmannin, WTN)后大鼠海马信号转导通路及线粒体凋亡通路相关蛋白水平的变化以及对自由基代谢的影响,由此深入研究癫痫发病的分子生物学机制,探讨二氮嗪的抗癫痫作用及潜在的保护机制。本研究分三个部分：目的观察mitoKATP通道开放剂DZ对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠模型行为学、海马神经元损伤的影响,以探讨DZ对癫痫发作后神经元的保护作用及相关机制。方法成年雄性Wistar大鼠随机分为对照组(control)、pilo致痫24h组(pilo)、DZ预处理组(pilo+DZ,即DZ)、DZ+5-羟基癸酸(5-HD)组(pilo+DZ+5-HD,即5-HD),DZ+渥曼青霉素(WTN)组(pilo+DZ+WTN,即WTN)。DZ,10mg/kg,在匹鲁卡品注射之前30分钟腹腔注射；5-HD,5mg/kg,DZ之前15分钟腹腔注射；WTN,15ug/kg,DZ之前15分钟腹腔注射,观察各组大鼠行为学变化,记录各组大鼠达到Ⅳ级和Ⅴ级发作的成功率和达到Ⅳ级发作潜伏期。SE持续60min以后腹腔注射地西泮终止发作。于癫痫发作后24h以多聚甲醛灌注取脑,石蜡包埋切片,采用HE染色和Nissl染色观察各组大鼠海马神经元的损伤情况。结果1.行为学表现：根据Racine发作评分标准,达到Ⅳ-Ⅴ级发作的大鼠被认为是诱发SE成功,表现为双侧前肢的阵挛、抽搐及全面性强直-阵挛发作,双侧后肢的强直伴身体直立、躯干背曲强直、跌倒。氯化锂-匹鲁卡品诱发大鼠达到Ⅳ级发作的成功率38.9%,达到Ⅴ级发作的成功率为61.1%。DZ处理组大鼠达到Ⅳ级发作潜伏期(67.8±9.6min)明显延长(p<0.05,),相比氯化锂-匹鲁卡品处理组(42.3±6.2min),且到达V级发作的百分率低得多(19.9%)(p<0.05)。另外,pilO+DZ+5-HD组和pilo+DZ+WTN组与单用DZ处理组相比,大鼠达到Ⅳ级发作潜伏期明显缩短(p<0.05),且到达V级发作的百分率增高(p<0.05)。对照组动物未表现出任何行为学上的癫痫发作。2.HE和Nissl染色显示：正常大鼠海马CA1和CA3区锥体细胞结构清晰且完整,排列紧密。细胞核结构正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富。癫痫发作后24h大鼠海马CA1和CA3区可见部分神经元脱失、细胞排列紊乱,细胞轮廓模糊,可见部分胞质浓缩,核固缩,胞浆内尼氏小体减少。DZ预处理组能显著减轻SE后24h组CA1和CA3区的海马神经元损伤情况,但这种保护作用可被5-HD部分阻断。结论根据氯化锂-匹鲁卡品腹腔注射后大鼠行为学和海马组织病理学的改变,表明氯化锂-匹鲁卡品可致大鼠急性癫痫发作(即SE),进而可引起大鼠海马神经元损伤。根据二氮嗪处理组能减少氯化锂-匹鲁卡品腹腔注射后大鼠的痫性发作和减轻海马组织病理学的损伤,说明二氮嗪对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元具有保护作用。目的观察mitoK-ATP通道开放剂DZ对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元PI3K/Akt信号通路及线粒体凋亡相关蛋白如凋亡诱导蛋白(AIF),细胞色素C(Cyt C)和活性caspase-3水平的变化,探讨DZ对癫痫大鼠海马神经元的保护机制。方法成年雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、癫痫发作后2h、8h、16h、24h和72h组。在检测DZ对海马神经元保护作用时分为对照组(control)、pilo致痫24h组(pilo)、DZ预处理组(pilo+DZ,即DZ)、DZ+5-羟基癸酸(5-HD)组(pilo+DZ+5-HD,即5-HD),DZ+渥曼青霉素(WTN)组(pilo+DZ+WTN,即WTN)。SE后分别在相应的时间点断头取脑,分离海马,提取蛋白,用Western blot法检测各组大鼠海马磷酸化Akt (phospho-Akt, p-akt),线粒体AIF (mito-AIF)和细胞核AIF (nu-AIF),线粒体CytC (mito-CytC)和胞浆CytC (cyto-CytC)以及活性caspase-3的水平。结果1.与正常对照组比较,大鼠海马p-akt的水平在癫痫发作后2h明显的反应性增高(p<0.05),而2h后则逐渐下降。AIF从海马线粒体到细胞核的转位从癫痫发作后2h开始,24h到达顶峰。同样的,Cyt C在线粒体的表达显著降低(p<0.05),海马活性caspase-3蛋白在癫痫发作后24h出现,直至癫痫发作后72h是逐增的。2.与pilo组比较,DZ预处理组在癫痫发作后24h使p-akt表达升高,AIF从线粒体到细胞核的转位减少(p<0.05),活性caspase-3蛋白的水平明显降低(p<0.05)及CytC由线粒体到胞浆的释放减少(p<0.05)。3.与DZ预处理组相比,pilo+DZ+5-HD组和pilo+DZ+WTN组使升高的p-akt蛋白表达显著降低(p<0.05),减少的海马细胞核中的AIF和胞浆中的CytC的表达明显增高(p<0.05),而降低的活性caspase-3蛋白的水平明显增高(p<0.05)。结论二氮嗪可通过开放mitoKATP通道,激活PI3K/AKT通路,减少AIF的核转位和CytC的释放,抑制caspase-3的激活,从而抑制氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠SE后海马神经元的凋亡。二氮嗪对癫痫发作所致的海马神经元损伤具有神经保护作用,进而为癫痫的神经保护治疗提供了新的治疗靶点。本研究阐明了癫痫发作后海马神经元损伤的分子生物学机制,为癫痫的神经保护治疗提供了理论依据。目的观察mitoKATP通道开放剂DZ对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马氧化应激的影响,进一步探讨DZ对癫痫发作后海马神经元的保护作用及其相关机制。方法成年雄性Wistar大鼠随机分为①对照组(control)；②pilo致痫24h组(pilo)；③DZ预处理组(pilo+DZ,即DZ)；④DZ+5-羟基癸酸(5-HD)组(pilo+DZ+5-HD,即DZ+5-HD)；⑤DZ+渥曼青霉素(WTN)组(pilo+DZ+WTN,即DZ+WTN)；⑥5-HD单独组(5-HD)及⑦WTN单独组(WTN)。对4组和5组,匹鲁卡品在DZ注射后30min腹腔注射,对6组和7组,匹鲁卡品在5-HD或WTN注射后45min腹腔注射。用氯化锂-匹鲁卡品制作SE模型,分别在SE后2h、24h、72h和7d对大鼠断头取脑,分离海马,检测海马中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活力。结果1.大鼠癫痫发作后2h MDA含量开始升高,在7d达到顶峰。SOD水平在癫痫发作后24h与对照组相比明显下降(p<0.05),但在癫痫发作后2h,72h与7d与对照组相比无统计学差异。2.与pilo组相比,DZ预处理组能明显降低大鼠SE后海马中MDA的含量(p<0.05),升高SOD的活力(p<0.05)。Pilo+DZ+5-HD组完全阻断DZ介导的MDA的含量的下降与SOD活力的升高(p<0.05)。与DZ预处理组相比,用WTN抑制PI3K的激活能使降低的MDA含量显著升高(p<0.05),增加的SOD表达明显降低(p<0.05)。同样的,5-HD单独组与WTN单独组能加重癫痫诱导的氧化应激损伤(p<0.05)。结论在氯化锂-匹鲁卡品致痫的大鼠模型中,二氮嗪通过激活PI3K/AKT信号通路来上调SOD和下调MDA含量,保护癫痫后海马神经元,减少神经元细胞死亡,减轻氧化应激损伤。二氮嗪是治疗癫痫发作后海马神经元损伤的潜在方法。