在全身恶性肿瘤中,恶性胶质瘤的5年死亡率就仅次于胰腺癌和肺癌,5年生存率不足5%。脑胶质瘤约占颅内肿瘤的半数以上,脑胶质瘤的发病率为3---10/10万,占全身恶性肿瘤的1---3%。低级别胶质瘤在病理上近于良性,侵袭性较小,即便如此,仍有将近一半的病人存活期不超过5年,肿瘤将从恶性程度较低的胶质瘤发展到恶性程度较高的胶质瘤,最后患者差不多都由于肿瘤复发和/或局部侵袭而死亡。目前手术切除是胶质瘤是最基本、最直接的治疗方法,治疗作用十分明确,其主要目的是降低致残率和死亡率,最大程度的提高患者的生存质量和生存时间。但由于胶质瘤多呈侵润性生长,手术过程中难以通过肉眼分辨其明确边界,肿瘤常常难以彻底完全切除,因此在术后常常需要辅以放疗、化疗。另有一部分患者因病变较小、位于功能区或因年龄较大、身体一般状况差,拒绝或不宜行开颅手术治疗而单纯选择放疗或化疗作为治疗手段。放射治疗主要是利用放射线的穿透性和使生物细胞电离的特性,常用的射线有X线和γ线等,X线和γ线等进入组织后和活体组织中的原子相互作用,传递电离辐射能量。具有生物活性的组织吸收电离辐射能量后产生一系列异常复杂的物理、化学和生物学变化而导致组织的放射性损伤。放射治疗包括普通放射治疗、组织间的近距离照射和精确放射治疗,精确放射治疗又包括三维适形或调强放射治疗以及立体定向放射治疗(即X刀、γ刀)。无论采用哪种放射治疗方法,它们均是通过使用x射线、Y射线等引起肿瘤组织、细胞的电离辐射效应而达到治疗目的。胶质瘤的化学药物治疗和手术、放射治疗一起构成了胶质瘤综合治疗体系,化学治疗可以杀死手术后或者放疗后的微小病灶,延缓胶质瘤的复发；或者使原本不能手术或不适宜手术的病人可以接受手术。但化学药物治疗也有比较大的副作用,全身用药毒性较大,同时可能对患者的免疫系统造成抑制。化学治疗药物分为两大类,分别为细胞周期特异性药物和细胞周期非特异性药物。在选择化疗方案时常常考虑两类药物联合使用。虽然目前胶质瘤的综合治疗体系包括手术、放疗和化疗以及目前正在进行临床研究的基因治疗、免疫治疗等,但是胶质瘤的疗效在10余年内仍然没有明显进展,最后患者几乎由于肿瘤局部扩散或局部侵袭或复发死亡。特别是恶性胶质瘤的治疗,即使手术加放化疗的中位生存期也仅为14.6个月[4]。目前神经外科学者普遍认为,胶质瘤治疗的关键问题在于现有治疗不能有效抑制或延缓肿瘤复发。最近的研究认为[6],肿瘤是由一小群具有无限增殖及自我更新能力的干细胞样细胞及由其产生的分化程度不均一的细胞团组成,这群干细胞样细胞被称为肿瘤干细胞(Tumor stem cell,TSC),而肿瘤的主体却是由失去了自我更新能力的具有一定分化特征的非干细胞样细胞组成。肿瘤干细胞假说最重要的特征是,肿瘤中仅肿瘤干细胞具有产生肿瘤及导致肿瘤治疗后复发的能力。肿瘤干细胞学说[7]的提出对于认识肿瘤的本质,开发新的肿瘤治疗方法具有重要意义,传统的治疗方法,包括手术、放疗和化疗,是以整体肿瘤细胞作为治疗靶的,并没有专门针对于肿瘤干细胞。治疗的结果就极有可能剩下具有致瘤性并对治疗具有更强抵抗性的肿瘤干细胞,从而导致肿瘤容易复发,难以根治。胶质瘤干细胞就是在此基础上逐渐提出来的,最早被称为神经干细胞样细胞(neural stem-like cell)。胶质瘤干细胞学说的重要意义在于,如果我们能够特异性的识别胶质瘤干细胞,并开发出特异性针对胶质瘤干细胞的靶向治疗方法我们就才有可能彻底征服胶质瘤。根据上述肿瘤干细胞和胶质瘤干细胞的学说,认为在脑肿瘤组织和体外培养的胶质瘤细胞系中存在有胶质瘤干细胞,并且由于胶质瘤干细胞对目前的治疗方法具有一定的抵抗作用而导致胶质瘤在治疗后部分干细胞存活下来,导致胶质瘤在术后出现复发。本课题就是在这样的思路下进行设计进行的。首先在第一部分,我们将两例新鲜恶性胶质瘤组织细胞和U251细胞接种在含血清培养基中,待细胞生长良好时,将细胞接种至无血清培养基中(DMEM/F12培养基,内含B2720u1/ml,bFGF20ng/ml,EGF20ng/ml,LIF10ng/ml)收集悬浮生长的神经球样细胞,这些神经球样细胞经过无血清培养、传代和扩增后,再通过免疫荧光细胞化学的方法来检测这些神经球样细胞是否表达干细胞表面标志物CD133和ABCG2:再通过流式细胞仪检测在无血清培养基中悬浮生长形成的球样体细胞CD133和ABCG2的表达；然后运用免疫磁珠分选的方法,以CD133为标志物,分选出CD133表达阳性的胶质瘤干细胞；通过反复传代培养的方式、单细胞克隆形成的方法和细胞移植裸鼠致瘤等方法来对其干细胞特性进行检测。结果我们发现,在新鲜的胶质瘤组组织细胞和U251细胞系中,通过在无血清培养基中培养后,可以得到呈悬浮生长的细胞球；经过免疫荧光细胞化学法检测,可以发现细胞球细胞有明显CD133和ABCG2的阳性表达；但经过流式细胞仪检测CD133和ABCG2的表达后发现,在悬浮生长的细胞球里,U251细胞球中CD133+细胞仅为3.17%,而ABCG2+细胞仅为1.17%；而在人新鲜胶质瘤组织细胞里,两者的阳性表达率分别为9.68%、11.25%和14.2%、17.8。经过CD133标记的免疫磁珠分选后CD133阳性表达分别为88.2%、91.5%、87.4%。我们将分选后的CD133+细胞和CD133-细胞分别进行了单细胞克隆形成试验,结果显示CD133+细胞克隆形成率达到78.5—92.4%,而CD133-细胞的仅有1.5%---4.7%。在裸鼠移植致瘤实验中,分别以CD133+细胞为102-103细胞/m1,CD133-细胞为1-5×105细胞/ml的密度以lml接种裸鼠腹部,CD133+细胞成瘤率达到80%(4/5)。通过第一部分的研究,我们发现：在胶质瘤组织和体外传代培养的U251胶质瘤细胞系中,的确有一小部分细胞表达干细胞表面标志物CD133和ABCG2;可在体外培养反复传代,保持自我更新和无限增殖能力；经过以CD133为标记的免疫磁珠分选后可以分离纯化胶质瘤干细胞；CD33+细胞的单细胞克隆形成率以及裸鼠移植成瘤率都比CD133-细胞高。因此,我们可以认为这一小部分表达干细胞表面标志物的细胞群就是胶质瘤干细胞。在第二部分中,我们将分离鉴定得到的胶质瘤干细胞,使用X线高能直线加速器对干细胞进行X线辐射处理,通过MTT比色法来检测辐射后不同时间的细胞活性变化情况；在辐射处理72小时后流式细胞仪检测CD133和ABCG2表达并用Hochest3325染色检测凋亡细胞核；使用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒来检测辐射处理后细胞的凋亡情况；通过以上的检测结果来研究胶质瘤干细胞对放射治疗的反应情况；最后我们将经过6Gy辐射处理后72小时的细胞与未经过X线辐射处理的细胞进行配对处理,在替莫唑胺(TMZ)半数抑制浓度作用48小时后MTT比色法进行细胞活性检测、Annexin V-FITC试剂盒检测细胞凋亡率,对目前胶质瘤临床治疗放化疗联合方案对胶质瘤干细胞的作用效果进行研究。结果显示：1在X线不同辐射剂量照射后,U251细胞以及U251肿瘤球细胞随着辐射剂量的增加以及作用时间延长,细胞的的活性显著下降(P<0.01)；在相同剂量的不同作用时间下细胞活性显著性下降(P<0.01),但在3Gy辐射剂量时,在48hr与72h之间U251细胞的活性差异性不显著(P=0.057)；2在X线照射处理72h后,流式细胞学检测CD133和ABCG2的表达,结果显示,在3Gy、6G.9Gy的X线照射72h后,CD133的表达由3.17%上升到4.74%、8.35%、13.24%；ABCG2的表达上升到1.48%、3.51%、8.76%。3在72h后,hochest染色可见到各期细胞凋亡的细胞核改变情况；4Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒分别检测了CD133+和CD133-细胞凋亡率以及人胶质瘤细胞系U251肿瘤细胞球和U251细胞凋亡率。其中CD133+细胞9Gy的剂量照射后72h的凋亡率分别为2.64±0.82%、4.53±1.19%、6.07±1.52%；CD33-细胞分别为9.73±0.92%、17.94±1.33%、25.19±1.56%；经过统计分析后发现：辐射处理后72小时CD133+细胞的凋亡率,在3Gy和6Gy放射剂量以及6Gy和9Gy放射剂量在统计学上没有差异性(P>0.05),3Gy和9Gy的剂量下,凋亡率有显著性差异(P<0.01)；CD133+细胞和CD133-阴性细胞、U251细胞以及U251细胞球细胞的凋亡率在同一X线剂量下有显著性差异(P<0.01)；U251细胞球细胞和CD133-细胞和U251细胞凋亡率在同一X线剂量下有显著性差异；U251细胞和D133-细胞之间在同一辐射剂量下凋亡率无统计学差异(P>0.05)。5将X线照射后CD133+细胞和CD133-细胞以及肿瘤球干细胞样细胞与未经照射处理的细胞配对处理后,接受替莫唑胺(TMZ)药物作用。分别在药物作用前和药物作用后48hMTT比色法检测细胞活性以及Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检查其凋亡率变化。结果显示sphere、 Sphere/IR、CD133+、CD133+/IR、CD133-、CD133-/IR各类细胞在药物作用前MTT比色法检测OD值为1.241±0.11、0.785±0.055、1.257±0.08、1.147±0.084、1.241±0.103、0.568±0.046；在48h后为0.569±0.032、0.424±0.036、1.142±0.071、0.907±0.042、0.632±0.063、0.234±0.040。在药物作用前的凋亡率分别是：0.53±0.12%、12.63±2.0%、0.40±0.09%、4.58±0.52%、0.60±0.4%、17.91±2.0%；药物作用48h后为18,75±2.7%、51.99±5.2%、2.62±0.7%、17.09±1.9%、21.98±3.4%、42.33±3.5%。经配对T检验和单因素方差分析表明在替莫唑胺(TMZ)作用前后,CD133+细胞在药物作用前后的OD值变化无统计学差异；其余不同细胞组在药物处理前后,其吸光度均有显著性差异(P<0.01)：在替莫唑胺(TMZ)作用前后,其他细胞组,和CD133+细胞组比较,其MTT比色法检测OD值变化有显著性差异(P<0.01)；但在辐射处理后的细胞之间,其OD值的变化无统计学差异；药物作用前后的凋亡率在不同细胞组之间,与CD133+细胞组比较,药物处理前后细胞的凋亡率有显著性差异(P<0.01)。通过第二部分的研究,我们发现：在X线不同辐射剂量照射后,细胞的活性随着放射剂量的增加和时间的延长而下降,凋亡率随着放射剂量的增加和时间的延长而逐渐增加；随着放射剂量的增加,悬浮生长的细胞球中干细胞标志物的表达增加；在辐射处理72小时后,免疫磁珠分选的CD133+细胞的凋亡率在3、6Gy和6Gy、9Gy之间在统计学上无显著性差异。这提示着表达CD133的胶质瘤干细胞对x线辐射具有一定的抵抗性,因而在辐射处理后,其细胞凋亡率没有随着辐射剂量的增加而出现相应的上升。我们将X线照射后CD133+细胞和CD133-以及肿瘤球干细胞样细胞与未经照射处理的细胞配对处理,分别检测在TMZ作用前后的细胞活性以及凋亡率的变化,发现以CD133为标志的胶质瘤干细胞对TMZ具有抵抗性,与辐射处理后的CD133+细胞相比,药物作用前后的MTT检测OD值以及凋亡率的变化均有显著性差异。总之,本实验研究结果表明：在脑肿瘤组织细胞和体外长期培养的胶质瘤细胞系U251中,存在着一小部分肿瘤干细胞,表达干细胞标志物CD133、ABCG2,可在体外反复传代,具有较强的致廇性。这一部分细胞对单独X线辐射以及TMZ化疗有一定的抵抗作用,但对二者的联合使用其治疗抵抗性下降。