枯草芽孢杆菌T7表达系统构建

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枯草芽孢杆菌是一种能快速生长又有强大蛋白分泌能力的安全性革兰氏阳性菌,可广泛应用于α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等蛋白的工业化发酵生产。但枯草芽孢杆菌原有的表达系统存在遗传转化效率低以及异源蛋白表达水平低等问题,无法满足科学研究以及日益增长的实际生产上需求。而T7表达系统是一种原核微生物的异源蛋白表达系统,具有遗传操作简单、表达基因调控严谨、蛋白表达效率高等优点。本课题拟开发出一套将枯草芽孢杆菌与T7表达系统两者的优势结合起来的高效异源蛋白表达系统。该系统包括两部分。(1)能够适用于高密度工业化发酵生产的T7表达系统宿主菌株。从枯草芽孢杆菌SCK6上敲除去upp基因,建立upp作为负筛选标记的无痕遗传操作系统,获得了菌株SCK8;之后为了减少发酵过程中的产孢子率和产泡率,再依次敲除spo IIAC基因和sfr AC基因,分别获得菌株SCK9以及SCK10;最后将T7 RNA聚合酶编码基因整合至SCK10的基因组amy E位点,获得菌株SCK22作为T7表达系统的宿主;(2)T7启动子调控表达目的基因的载体质粒。以绿色荧光蛋白(GFP)基因gfp为报告基因,设计了四种表达载体,即游离表达载体p HT01-T7-GFP和p HT7-GFP,基因组整合表达载体p SS-T7-GFP和p SS-T7lac-GFP。将质粒转化到SCK22或整合到SCK22基因组上,分别得到重组菌株SCK22/p HT01-T7-GFP、SCK22/p HT7-GFP、SCK24和SCK25。在相同的培养条件下,重组菌株SCK22/p HT7-GFP胞内GFP表达量最高。因此本论文以SCK22为宿主菌株,p HT7为目的基因表达载体构建T7表达系统。为了提高异源蛋白的表达水平,对重组菌株SCK22/p HT7-GFP的培养时间和诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度进行优化。结果表明在固定的培养条件(接种OD600为0.05、培养温度37℃、摇瓶转速250 rpm、IPTG浓度为1.00 mmol/L)下,培养7 h后菌体密度达到最大,GFP在胞内表达量最高可达到0.15 g/L,占胞内总蛋白量的22.24%。5 L发酵罐高密度发酵GFP的胞内表达量为2.94 g/L,占胞内总蛋白的15.70%。验证T7系统的适用性:表达了体外多酶催化淀粉产肌醇的6种异源蛋白(分别为异淀粉酶、α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、肌醇1-磷酸合成酶、肌醇单磷酸酶和4-α-葡聚糖转移酶)。SDS-PAGE电泳图谱显示这六种异源蛋白表达水平占胞内总蛋白量的10-40%,与大肠杆菌T7系统效率相当,而且基本不存在包涵体。重组菌株SCK22/p HT7-IMP在5 L罐中高密度发酵可生产4.78 g/L肌醇单磷酸酶,占胞内总蛋白的27.20%。所构建的SCK22菌株能进行高密度发酵,其具有的T7表达系统可稳定表达体外多酶催化淀粉产肌醇的六种酶蛋白。
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