沼泽红假单胞菌蛋白Rhp-PSP对病毒RNA降解及关键氨基酸位点

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植物病毒病是植物"癌症",目前尚无有效的防治方法。烟草花叶病毒是一种常见的植物病毒,其病毒粒子为直杆状结构,主要有核酸和外壳蛋白组成。由烟草花叶病毒引起的植物病症主要表现出畸形、花叶、生长陷入不良状态等症状。蛋白质农药,是一种新兴起的生物农药,属于蛋白激发子类药物。作为新型生物农药,蛋白质农药有望成为高效、绿色防控植物病毒病的新途径。从沼泽红假单胞菌菌分离的抗病毒蛋白Rhp-PSP,质谱分析显示,Rhp-PSP蛋白属于YjgF/YER057c/uK114家族蛋白成员,该家族蛋白的重要功能是对核酸的降解作用。先前研究已证实Rhp-PSP抗病毒蛋白对TMV病毒粒子有抑制作用,且抑制作用与蛋白对病毒核酸的作用有关。因此推测Rhp-PSP蛋白可能以病毒RNA为靶标,通过干扰其正常功能来抑制病毒的增殖。将Rhp-PSP蛋白及其家族同源蛋白氨基酸序列二级结构比对结果显示,Rhp-PSP蛋白结构中有5个关键位点,分别:第23位酪氨酸(Tyr23)、第72位天冬氨酸(Asn72)、第120位苯丙氨酸(Phe120)、第129位精氨酸(Arg129)、第143位谷氨酸(Gln143)。研究为了进一步阐明Rhp-PSP蛋白对TMV CP mRNA核酸体外降解作用及其关键氨基酸位点突变后蛋白降解核酸作用,选取Tyr23(酪氨酸)、Arg129(精氨酸)、Gln143(谷氨酸)3个位点进行突变,构建突变蛋白原核表达载体。利用Northern blot技术检测Rhp-PSP蛋白及突变蛋白对TMV CP mRNA降解作用。结果表明,Rhp-PSP蛋白对TMV CP mRNA具有降解作用;Arg129突变后,突变蛋白不具有降解核酸作用,而Tyr2 3和Gln143突变后,突变蛋白仍具有降解TMV CP mRNA作用。这说明,Rhp-PSP蛋白行使降解核酸作用的关键位点在129位精氨酸上。半叶法接种心叶烟实验验证Rhp-PSP蛋白、突变蛋白对TMV病毒粒子与TMV-RNA抑制作用,实验结果同Northern blot检测Rhp-PSP蛋白及突变蛋白对TMV CP mRNA降解作用效果一致。实验结论得出,Rhp-PSP蛋白对核酸具有降解作用,且Rhp-PSP蛋白降解核酸的关键位点在C-端附近的β折叠上129位精氨酸上。Rhp-PSP蛋白通过Arg129位结合病毒RNA并参与其随后的降解,以实现对病毒增殖的抑制作用。
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