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目的微小RNA (microRNA,miRNA)是近年来发现的一类21-25个核苷酸的内源性非编码小RNA, miRNA基因先转录产生miRNA的初级产物-pri-miRNA,它被RNaesⅢ内切酶切割成70个核苷酸序列的miRNA的前体-pre-miRNA, pre-miRNA再被Dicer酶切割成约22nt的miRNA的成熟体。成熟的miRNA形成RNA诱导沉默复合体,成熟miRNA的5’-非翻译区的2-7个核苷酸的“种子序列”可以与靶mRNA的3’-非翻译区互补结合,在转录后水平上抑制靶基因的表达。1993年,首个miRNA-lin-4被发现,从此揭开了对miRNA研究的序幕。随后,许多实验室从线虫、果蝇、家鼠、拟南芥及人类等多种真核生物中发现了至少500种这类小分子RNA,其中在人类染色体上就有300余种,占人类基因的1-4%。MiRNA的编码基因是目前最大的一类调节基因。它在细胞的生长、增殖、发育和凋亡过程中发挥着重要作用,并与许多肿瘤的发生、发展相关。MiRNA在肿瘤中发挥着相当于癌基因或抑癌基因的作用,调节着肿瘤细胞的多种重要生物学行为。大肠癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,它的发病是多因素、多步骤的复杂过程。目前发现很多miRNAs在大肠癌中异常表达。MiR-143和miR-145作为较早在大肠癌中发现的miRNAs,已证实在大肠癌中存在异常表达。let-7也是较早发现在大肠癌中异常表达的miRNA,通过进一步的研究证实,它不仅在大肠癌的发生而且在大肠癌的发展过程中也发挥了重要的作用。越来越多的研究表明,miRNA与大肠癌有着非常密切的关系。随着研究的不断深入,miRNA在大肠癌的基因诊断和治疗中将发挥重要的作用。在本研究中,我们参考国内外相关文献及前期关于大肠癌的miRNA表达谱的研究,初步确定miR-148b为我们的研究重点。利用定量real-time PCR技术检测了大肠癌组织相对于癌远端非瘤组织中miR-148b的表达及与其有相同的“种子序列”的miRNAs (miR-148a和miR-152)的表达情况。通过使大肠癌细胞系中过表达miR-148b,初步探索其在大肠癌的发生、发展中的作用。方法一、MiR-148b在大肠癌组织中的表达收集101例大肠癌患者肿瘤及周围非瘤组织手术标本,经提取RNA,加尾,抽提纯化,反转录后得到cDNA模板,运用定量real-time PCR检测miR-148b的相对于癌旁非瘤组织的表达量。如果相对表达量小于1,则被认为是低表达。反之,被认为是高表达。然后运用统计学方法分析miR-148b与临床病理资料之间的相关性。二、MiR-148b在大肠癌细胞系中的表达及其对细胞增殖的影响由于没有正常的大肠粘膜细胞系,我们在大肠癌组织中随机选择了三个癌旁非瘤组织作为大肠癌细胞系的阴性对照。运用定量real-time PCR检测出miR-148b在大肠癌细胞系(HT-29和HCT-116)中的表达情况。向大肠癌细胞系中(HT-29和HCT-116)转染miR-148b mimics,使miR-148b在大肠癌细胞系过表达,通过MTS实验检测转染miR-148b mimics后对细胞增殖的影响。三、MiR-148a及miR-152在大肠癌组织及细胞系中的表达运用定量real-time PCR检测101例大肠癌组织标本中miR-148a及miR-152相对于周围非瘤组织的表达量,然后运用统计学方法分析二者与临床病理资料之间的相关性。然后,提取大肠癌细胞系HCT-116和SW-620的RNA,经加尾,抽提纯化,反转录后,运用定量real-time PCR检测这两个细胞系(HCT-116和SW-620)中miR-148a和miR-152相对于非瘤组织的表达量。运用统计学方法分析miR-148a、miR-148b和miR-152三者在大肠癌组织中表达的相关性。结果一、MiR-148b在大肠癌组织中的表达1、在人大肠癌组织中发现miR-148b较其相应周围非瘤组织低表达。在101例大肠癌组织中,其中84(83%)例miR-148b (p<0.001)低表达,miR-148b在大肠癌组织中相对于周围非瘤组织表达的中位数是：0.16。MiR-148b的低表达与肿瘤的大小(p<0.001)和浸润深度(p=0.012)相关。肿瘤越大、浸润越深,miR-148b的表达量越低。2、PCR产物经TA克隆,DNA测序后与miRBase上公布的miR-148b序列比对正确、完整。二、MiR-148b在大肠癌细胞系中的表达及其对细胞增殖的影响定量real-time PCR结果显示,miR-148b在人大肠癌细胞系HT-29(p<0.001)和HCT-116 (p<0.001)中均有不同程度的低表达。HT-29及HCT-116在转染了miR-148b mimics后,经定量real-time PCR检测验证,转染了miR-148b mimics的实验组细胞系中,miR-148b的表达水平相对于对照组均有不同水平的提高。应用MTS法绘制的生长曲线表明,对于HT-29细胞系,转染了miR-148b mimics实验组的细胞在48小时开始其增殖速率明显低于阴性对照及空白对照组(p<0.05)。对于HCT-116细胞系,转染了miR-148b mimics实验组的细胞在72小时开始其增殖速率明显低于阴性对照及空白对照组(p<0.05)。三、MiR-148a及miR-152在大肠癌组织及细胞系中的表达1、在人大肠癌组织中发现miR-148a及miR-152较其相应周围非瘤组织低表达。在101例大肠癌组织中,其中69(68%)例miR-148a(p<0.001)低表达,80(79%)例miR-152 (p<0.001)低表达,miR-148a及miR-152在大肠癌组织中相对于周围非瘤组织表达的中位数分别是：0.36和0.11。MiR-148a和miR-152的低表达与肿瘤的大小(p=0.018和p=0.004)和浸润深度(p=0.023和p=0.002)相关。肿瘤越大、浸润越深,这两种miRNAs的表达量越低。2、定量real-time PCR结果显示,miR-148a及miR-152在人大肠癌细胞系HCT-116 (allp<0.001)及SW-620 (all p<0.001)中的表达均较癌旁非瘤组织有不同程度的下降。3、MiR-148a、miR-148b及miR-152三种miRNAs的表达在大肠癌组织中存在显著的相关性(p<0.001)。4、MiR-148a及miR-152的PCR产物经TA克隆,DNA测序后与miRBase上公布的序列比对正确、完整。结论1、大肠癌组织中miR-148b的表达量显著低于其周围非瘤组织。MiR-148b的低表达与肿瘤大小及浸润深度相关,肿瘤越大、浸润越深,miR-148b的表达量越低。2、大肠癌细胞系HT-29和HCT-116中,miR-148b的表达量显著低于非瘤对照组。3、MiR-148b的过表达抑制了大肠癌细胞的增殖。4、大肠癌组织中miR-148a及miR-152的表达量显著低于其周围非瘤组织。MiR-148a和miR-152的低表达与肿瘤大小及浸润深度相关,肿瘤越大、浸润越深,这两种miRNAs的表达量越低。5、大肠癌细胞系HCT-116及SW-620中,miR-148a及miR-152的表达量显著低于非瘤对照组。6、MiR-148a、miR-148b及miR-152三种miRNAs在大肠癌组织中的表达存在显著的相关性。