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目的阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)可导致或加重认知功能障碍,其机制与间歇低氧(IH)所致海马神经细胞凋亡有关。我们前期研究已证实间歇低氧可以诱导自噬激活并加重了海马神经细胞凋亡。然而,间歇低氧是如何诱导海马神经细胞自噬激活并加重凋亡的,其具体机制仍不清楚。低氧诱导因子1(HIF-1)是由对氧敏感的α亚基和结构亚基β亚基组成,在低氧、缺血/再灌注等处理后其表达均明显增加并可以介导细胞自噬激活。此外,HIF-1α的下游靶蛋白BNIP3与自噬相关蛋白Beclin1的表达也密切相关。因此,我们推测HIF-1α可能介导了间歇低氧致海马神经细胞凋亡中自噬的变化。本研究通过间歇低氧处理海马神经细胞建立OSAHS模型,应用药物干预HIF-1α表达及多种分子生物学检测技术,检测各组海马神经细胞自噬强度和HIF-1α-BNIP3-Beclin1信号通路及细胞凋亡的变化,研究间歇低氧是否通过HIF-1α-BNIP3-Beclin1信号通路介导了海马神经细胞自噬激活并促进了细胞凋亡。方法(1)研究对象:取新生SD乳鼠(出生24h内),剥离出海马组织,制备细胞悬液,接种并行原代海马神经细胞培养,普通光学显微镜下观察海马神经元的生长情况。(2)模型建立与分组:建立不同时间段的间歇低氧细胞模型,设正常对照组(NC)、间歇低氧4h、8h、12h组。IH组循环给予常氧21%O2持续10min,低氧1.5%O2持续5min,分别处理4h、8h和12h,NC组持续给予21%浓度的常氧。(3)药物干预与分组:给予YC-1干预HIF-1α表达,设正常对照组、IH组、YC-1干预组、IH+YC-1干预组。选取HIF-1α及自噬表达变化最明显的间歇低氧时间点12h进行处理,YC-1预处理方法:YC-1稀释液在间歇低氧或常氧前预处理2h。(4)检测指标:通过免疫荧光染色检测海马神经细胞膜标记蛋白MAP-2的表达;通过western blot技术和免疫荧光技术检测各组海马神经细胞LC3-II和cleaved-caspase-3以及HIF-1α-BNIP3-Beclin1信号通路相关蛋白的表达变化,TUNEL法检测各实验组海马神经细胞凋亡率。结果(1)海马神经细胞的生长状态观察:光学显微镜下观察到成熟的海马神经细胞呈现出聚集生长趋势,神经元的轴突和树突增粗并相互交织形成网状,且免疫荧光显示海马神经细胞特异性表达MAP-2。(2)间歇低氧对海马神经元HIF-1α和LC3-II蛋白表达的影响:western blot法检测结果显示,IH组HIF-1α和LC3-II蛋白表达均明显增多,两种蛋白表达均与间歇低氧时间有关,间歇低氧12h表达最多,与NC组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫荧光染色检查显示间歇低氧处理后分别代表HIF-1α、LC3-II绿色荧光增加(P<0.05)(3)干预HIF-1α表达对海马神经元的自噬水平影响:western blot检测结果显示,与NC组相比IH组LC3-II蛋白表达显著增多,差异具有统计学意义(P<0.05);YC-1+IH组LC3-II表达较IH组明显减少(P<0.05)。免疫荧光检测结果显示,与对照组相比IH组代表LC3-II的绿色荧光点数显著增多(P<0.05);YC-1+IH组绿色荧光点数较IH组明显减少,差异均具有统计学意义(P<0.05);(4)干预HIF-1α表达对原代海马神经细胞凋亡的影响:western blot技术检测结果显示,IH组cleaved caspase-3蛋白表达明显增多,并与间歇低氧时间有关,间歇低氧12h表达最多,与NC组相比差异具有统计学意义(P<0.05);YC-1+IH组cleaved-caspase3蛋白表达较IH组明显减少(P<0.05);TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测结果也显示,间歇低氧处理后细胞凋亡阳性细胞数增加(P<0.05),YC-1+IH组细胞凋亡阳性细胞数较IH组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)干预HIF-1α表达对海马神经细胞HIF-1α-BNIP3-Beclin1通路蛋白及自噬标记蛋白LC3-II表达的影响:western blot技术检测结果显示,IH组HIF-1α、BNIP3、Beclin1和LC3-II蛋白表达明显增高,且随着间歇低氧时间的增加,蛋白表达也逐渐增多IH12h表达最多,与正常对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);YC-1+IH组HIF-1α、BNIP3、Beclin1和LC3-II蛋白表达较IH组明显减少,差异均具有统计学意义(P<0.05);YC-1单独给药组HIF-1α、BNIP3、Beclin1和LC3-II蛋白表达与对照组无显著差异。结论本研究证实:(1)间歇低氧处理后海马神经细胞自噬激活伴随着HIF-1α高表达;(2)间歇低氧状态下抑制HIF-1α的表达后自噬标记蛋白LC3-II表达也降低;(3)间歇低氧状态下海马神经细胞凋亡蛋白cleaved-caspase3表达增加,抑制HIF-1α的表达后cleaved-caspase3蛋白表达明显减少。(4)间歇低氧状态下HIF-1α-BNIP3-Beclin1信号通路蛋白表达均增加,抑制HIF-1α的表达后HIF-1α-BNIP3-Beclin1信号通路蛋白表达均降低。综上所述,间歇低氧状态下,HIF-1α可能通过HIF-1α-BNIP3-Beclin1信号通路介导了自噬激活并加重了海马神经细胞凋亡。