外套膜是贝壳形成的重要器官,按照不同部位结构特征和功能的不同,外套膜从壳顶向壳低方向大致可以分为三个区域:边缘膜区(marginal zone)、套膜区(pallial zone)、中央膜区(central zone)。一般认为,边缘膜区主要参与棱柱层的形成,套膜区和中央膜区主要参与珍珠层的形成。为了探究外套膜中央膜与边缘膜功能上的差异机制,课题组前期的研究中构建了马氏珠母贝中央膜与边缘膜mRNA和miRNA转录组数据库,本研究以此为基础,筛选中央膜和边缘膜差异表达的miRNA,随后通过mir-RACE技术验证筛选miRNA的序列,利用茎环引物荧光定量技术检测筛选miRNA的组织表达差异。通过生物信息学分析筛选miRNA的靶点,并使用双荧光素酶实验验证miRNA与预测靶基因间的靶向关系。最后通过体内miRNA过表达实验,结合茎环引物荧光定量和扫描电镜观察,检测mi RNA对贝壳内表面结构及靶基因表达的影响,以此鉴定miRNA的功能及调控机制。主要研究结果如下:1.miRNA的筛选和鉴定:通过分析马氏珠母贝外套膜中央膜与边缘膜miRNA数据,从189条已知miRNA中分别筛选出3个边缘膜高表达的miRNA(mi R-124、miR-8-3p、mi R-9a-5p)和2个中央膜高表达的miRNA(miR-10a-3p、miR-183)。通过mir-RACE技术对上述5个miRNA进行了序列验证,结果表明miR-124、miR-8-3p、miR-9a-5p和miR-183的序列同测序结果相同,miR-10a-3p序列同测序结果相比3’端缺少一个碱基(T)。利用茎环引物荧光定量技术对5个mi RNA在边缘膜和中央膜的表达情况进行了鉴定,结果显示miRNA在中央膜和边缘膜的表达趋势与预测结果一致。2.miRNA的功能研究:通过扫描电镜观察,我们发现miR-9a-5p、mi R-10a-3p和miR-124过表达时,贝壳珍珠层的超微结构发生不同程度的紊乱,表明mi R-9a-5p、miR-10a-3p和miR-124参与调控马氏珠母贝珍珠层的形成。3.miRNA靶基因的预测及靶向关系验证:通过靶基因预测软件(RNAhybrid和miRanda),结合外套膜中央膜和边缘膜的转录组数据,根据mi RNA与其靶基因表达互补原则,预测miRNA的靶向调控基因。最终获得4个与马氏珠母贝免疫、生长或矿化相关的基因作为筛选miRNAs的靶点,其中miR-10a-3p的预测靶点为:nAChRsα、NPY和PfCHS1;miR-124的预测靶点为:nAChRsα、NPY和PfCHS1;miR-9a-5p的预测靶点为:TRAF2和PfCHS1。miRNA过表达后通过荧光定量分析发现mi R-9a-5p过表达可以降低PfCHS1基因的表达,miR-10a-3p过表达可以降低NPY基因的表达,进一步说明miR-9a-5p和PfCHS1p之间,miR-10a-3p和NPY之间存在靶向调控关系,同时也说明miR-9a-5p可能通过调控PfCHS1的表达,miR-10a-3p通过调控NPY的表达参与调控马氏珠母贝贝壳的形成。同时,我们还发现miR-9a-5p过表达还可以降低TRAF2的表达;miR-10a-3p过表达可以降低nAChRsα、PfCHS1的表达;miR-124过表达可以降低NPY、nAChRsα、PfCHS1的表达,说明它们之间存在间接的调控作用,但具体的调控机制还不清楚。双荧光素酶实验进一步证实了mi R-9a-5p和PfCHS1之间、miR-10a-3p和NPY之间存在靶向调控关系;其它的miRNA和预测靶点间不存在靶向调控关系。