据统计,在世界范围内,肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在常见恶性肿瘤的发病率排名第六位,在因恶性肿瘤原因致死的病例中排名第三位,于此同时,其发病率也在逐年上升。在我国,因为有为数众多的乙肝患者,所以HCC在恶性肿瘤的发病率中排名第二位。同时值得注意的是,因为区域经济发展不平衡,部分欠发达地区卫生情况落后,所以HCC的实际发病率和死亡率可能会高于所报道的数据。尽管医学研究在不断的进展,但HCC的早期诊断手段仍存在不足,大多数患者在其发病的中后期才确定诊断。即使如此,在对于获得早期诊断的患者来说,治疗手段仍然欠完善,经治疗后的长期生存率并未得到很大改善。伴随着生物医学的蓬勃发展,越来越多的基础研究聚焦到HCC的诊疗上来,并且取得了一系列的成果。尽管现在对于HCC的生物学发生发展机制尚未研究透彻,但也为其今后的诊疗奠定了一定的基础。细胞依靠多种信号转导途径来面对应激反应,泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system,UPS)是其中的一个重要信号转导途径,毛细血管扩张性共济失调症突变基因(Ataxia telangiectasia-mutated,ATM)和共济失调毛细血管扩张以及 Rad3 相关基因(Ataxia telangiectasia-mutated and Rad-3 related,ATR)是UPS系统中的两个关键激酶。在近期的一些研究中发现,环指和WD重复结构域相关蛋白 3(Ring finger and WD repeat domain 3,RFWD3)参与到了ATM/ATR通路应对DNA损伤修复。RFWD3作为ATM/ATR的磷酸化底物,作用于多重赖氨酸残基来参与到这个过程。此外还有文献报道,在DNA损伤发生后,RFWD3在被停止的复制叉处积累,与复制蛋白A(replicationproteinA,RPA)共同定位,并通过其WD40域在c端与RPA相结合,并在同源重组(homologous recombination,HR)之后促进复制叉的重新启动。目前尚未有RFWD3在HCC中的文献报告,其表达情况与HCC患者预后的关系,以及可能的机制也尚不清楚。值得注意的是,所有已知的包含E3结构域的配体大部分是p53的负调控因子,通过促进p53降解,抑制了对DNA损伤的反应。但在目前的文献中,拥有E3结构域的RFWD3能维持P53的稳定性,从而被认为是一种抑癌基因。而且在初期的小样本HCC筛查实验中,本研究发现与癌旁组相比,HCC组的RFWD3基因表达水平普遍升高。结合以上信息,RFWD3在HCC中具体扮演了什么角色,参与了什么进程,其内在机制是什么,是一系列需要深入研究阐述的问题。本课题拟从以下四个部分进行研究:第一部分通过临床标本检测了 HCC和癌旁中RFWD3的表达,结合相关临床数据分析其在HCC中所起到的作用;在第二部分通过构建慢病毒沉默下的RFWD3稳转肝癌细胞系,在体外实验中研究其细胞表型的影响;在第三部分通过构建裸鼠体内荷瘤模型,与体外实验相对应,进一步验证其在生物学行为的影响;在第四部分通过运用基因芯片和抗体芯片技术进行RFWD3在HCC中的可能分子生物学机制探索。最终论证RFWD3蛋白作为肝癌分子靶向治疗的潜在靶点的可能性,为进一步的基础以及临床试验提供理论依据。第一部分RFWD3在肝癌组织中的表达与患者临床指标以及预后的相关性分析目的:通过临床标本检测了 HCC和癌旁中RFWD3的表达,结合相关临床数据分析其在HCC中所起到的作用。方法:1.通过实时荧光定量聚合酶链锁反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)对57例HCC患者的癌和癌旁组织中RFWD3的mRNA表达量进行检测。2.通过蛋白质印迹法(Western Blot,WB),从上述57例HCC患者样本中,随机抽取16对组织样本(HCC及邻近的正常肝组织)进行RFWD3在HCC和癌旁组织中蛋白表达的检测。3.通过免疫组化(Immunohistochemical,IHC)法,从上述57例HCC患者样本中,以是否及时福尔马林保存并进行蜡块包埋为选择标准,最终选取32对组织样本(HCC及邻近的癌旁肝组织)进行RFWD3蛋白表达的检测,结合相关临床数据分析其与HCC之间的关系。4.为扩大样本量,减少抽样误差从而保证推算结果的精确度和可靠性,本研究还运用了 GEPIA数据库的数据作为补充验证,用于进行RFWD3表达和相关生存分析。结果:1.通过qRT-PCR,WB以及IHC检测发现,HCC组织中的RFWD3表达显著升高(P<0.05)。2.IHC结合临床数据分析发现,RFWD3的高表达情况与肿瘤体积较大和TNM分期较差显著相关(P<0.05)。3.生存分析发现,RFWD3的高表达患者拥有更短的总生存期,提示RFWD3在肝癌进展过程中可能发挥了重要促进作用(P<0.05)。第二部分体外RFWD3基因沉默表达后对HCC细胞表型的影响目的:构建在慢病毒沉默下的RFWD3稳转肝癌细胞系,并通过体外实验来研究其细胞表型的影响方法:1.验证肝癌细胞系 BEL-7404,HCC-LM3,BEL-7402 和 SMMC-7721 的RFWD3表达丰度。2.构建在慢病毒沉默下的RFWD3稳转肝癌细胞系(对照组:shCtrl;沉默组:shRNAi)。3.利用qRT-PCR,WB和荧光成像系统验证shRNAi沉默效率。4.MTT法检测shRNAi后对其增值能力的影响。5.流式细胞仪检测shRNAi后对其细胞周期状态的影响。6.流式细胞仪检测shRNAi后对其凋亡状态的影响。7.细胞划痕愈合实验检测shRNAi后对其迁移能力的影响。8.Transwell法检测shRNAi后对其迁移和侵袭能力的影响。结果:1.qRT-PCR验证发现,RFWD3在四种HCC细胞系中均稳定表达,其中BEL-7404 和 HCC-LM3 表达丰度最高(△cT>6)。2.慢病毒转染后,RFWD3的mRNA以及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。3.shRNAi后,细胞周期被阻滞在G2/M期,凋亡率上升,细胞的增殖情况受到抑制(P<0.05)。4.shRNAi后,侵袭和转移能力明显下降(P<0.05)。第三部分体内RFWD3基因沉默表达后对HCC生物学行为的影响目的:构建在慢病毒沉默下的RFWD3稳转肝癌细胞系,并通过体内荷瘤实验来研究其生物学行为的影响。方法:1.s RNAi细胞构建裸鼠皮下HCC成瘤模型。2.s RNAi细胞构建裸鼠尾静脉注射HCC肺转移模型。3.利用影像学以及HE染色等方法,检测其生物学行为的影响。结果:1.裸鼠皮下HCC成瘤模型中,shRNAi组肿瘤体积明显减小(P<0.05)。2.裸鼠尾静脉注射HCC肺转移模型中,shRNAi组肺部体积无明显增大,肿瘤明显减少(P<0.05)。3.裸鼠尾静脉注射HCC肺转移模型中,HE染色证实shRNAi组肺部肿瘤转移灶数量和体积均明显减少(P<0.05)。第四部分RFWD3在HCC中的分子生物学机制研究目的:运用基因芯片和抗体芯片技术,进行RFWD3在HCC中的可能分子生物学机制探索,论证RFWD3蛋白作为肝癌分子靶向治疗的潜在靶点的可能性,为进一步的基础以及临床试验提供理论依据。方法:1.运用蛋白抗体芯片检测shRNAi后Stress and Apoptosis信号通路中相关基因表达情况。2.运用基因表达芯片检测shRNAi后基因表达谱改变情况。3.利用IPA分析相关网络调控机制。结果:1.蛋白抗体芯片检测StressandApoptosis信号通路中相关基因,其通路中IkB α(Total),Survivin 和 α-Tubulin 蛋白的表达水平显著下调,P44/42 MAPK(ERK1/2),HSP27,p53,SAPK/JNK,Chk1,Chk2,IkB α(Ser32/36),eIF2α和TAK1蛋白磷酸化水平显著下调(P<0.01)。2.经筛选,基因表达谱芯片数据显示有454个基因mRNA表达有明显改变(above 2-fold,P<0.05)。3.IPA分析发现在细胞生存以及凋亡,细胞运动和侵袭,细胞装配以及DNA复制、重组和修复等相关性基因方面有明显富集情况。而且IPA分析表明,Wnt/β-catenin以及TGF-β signalling信号通路也有明显改变(P<0.05)。全文结论1.RFWD3基因在肝癌中表达升高,并和肿瘤大小以及TNM分期密切相关,RFWD3低表达的HCC患者生存时间高于RFWD3高表达患者。2.沉默RFWD3后,体外实验证实HCC细胞周期被阻滞在G2/M期,凋亡率上升,增殖被抑制。此外HCC细胞的侵袭以及转移能力显著下降。3.沉默RFWD3后,体内实验证实肝癌细胞的生长,侵袭和转移能力明显下降。4.RFWD3通过调控MAPK、Wnt/β-catenin以及TGF-β基因通路来影响HCC的肿瘤发展进程。