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FL是新发现的早期造血生长因子，具有刺激机体造血和增强机体 免疫功能的双重作用。为了观察肝癌局部FL基因转移的抗肿瘤效果， 本实验选择重组腺病毒作为携带mFL的载体。首先，应用高效细菌内 同源重组系统，构建了携带mFL的重组腺病毒载体。PCR扩增含有mFL 的质粒，构建重组穿梭质粒，线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1 共转化BJ5183大肠杆菌，并在其中发生同源重组，利用抗性的变化筛 选重组腺病毒质粒。Lipofectamine转染293细胞，重组腺病毒AdmFL 在其中复制和扩增，利用重组整合入腺病毒骨架中的绿色荧光蛋白 (GFP)可以直接地观察转染与感染的效率。反复“感染-收集-冻融”， 将108感染后的293细胞裂解上清CsC1梯度超速离心纯化，测定AdmFL 酒度为8.4×1011efu/ml，空载体对照病毒为6.2×1011efu/ml。本买验构建 的腺病毒为下一步动物体内实验奠定了基础。 体外分别以MOI为10、100、500的AdmFL感染小鼠肝癌细胞 Hepal-6，两天后荧光显微镜下根据GFP的表达计算感染率分别是5%、 60%和95%。体外以MOI为100的AdmFL对体卜感染后的Hepal-6 细胞无直接的生长抑制作用。在感染后的Hepal-6细胞内RT-PCR扩 增到了mFL的mRNA，应用ELISA检测培养上清中mFL蛋白的浓度 为80.5±7.3ng/ml，证明腺病毒能有效地感染靶细胞，并介导所携带mFL 的高效表达。 肿瘤内注射1×109efu AdmFL对C57BL/6小鼠肝癌有明显的治疗作 用。建立小鼠的异位肝癌模型，分别肿瘤内单次注射1×109efuAdmFL、 空病毒载体对照和PBS对照，观察平均肿瘤大小和小鼠生存率。与对 照相比，AdmFL能明显地抑制肿瘤生长，治疗后37天 89%(8/9)的 小鼠肿瘤完全消退，并显著延长荷瘤小鼠的生存期。同时，AdmFL还 能激发特异性免疫保护反应，保护了100%(6/6)的肿瘤消退小鼠免 于对侧Hepa1-6的再次攻击，而不能保护EL-4淋巴瘤细胞(0/6)。AdmFL 治疗后20天的脾细胞体外杀伤靶细胞Hepal-6的活性增强，在效靶比 2 为100：1时，青使28．3％的靶细胞被杀伤，而A常小鼠脾细胞对靶细胞 的杀伤仅为4石％，同时，治疗组小鼠脾细胞过继给正常小鼠，能提供 对Hepal6的特异性保护。 治疗后7天肿瘤局部病理学观察显示，AdmFL引起了肿瘤局部出 血坏死，炎细胞侵润，免疫组织化学提示局部侵润的cos飞胞明显多 于空载体治疗组。 从正常人外周血单个核细胞中RTICR克隆可溶性人FL胞外区基 因。除全长胞外区以外，还克隆到两个新的差异剪接体。应用细菌内 同源重组系统构建携带540hp全长可溶性胞外区ML的重组腺病毒， 其滴度为 7石 xlo‘’efu／ml，为开展人 FL基因治疗肿瘤研究提供了实验 基础。