论文部分内容阅读
磷胁迫条件下,植物通过一系列生理生化变化主动适应低磷逆境,包括对土壤难溶性磷的活化,根系对低浓度有机磷的有效吸收、转运和有效利用,植物磷转运蛋白(Phosphorus Transporter,PT)及紫色酸性磷酸酶(Purple Acid Phosphatase,PAP)在植物响应低磷胁迫过程中起着重要作用。马尾松(Pinus massoniana)是我国亚热带地区重要的造林先锋树种,特别是对南方低磷环境表现出很强的适应能力,说明马尾松具有适应壤缺乏磷的应对机制。课题组在前期工作中克隆了马尾松磷磷转运蛋白基因(PmPT3)与紫色酸性磷酸酶基因(PmPAP1)并在mRNA水平上分析其与磷胁迫的关系。为了进一步验证这2个基因在磷胁迫中的功能,本文拟通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化模式植物烟草,对转基因植株进行不同磷浓度处理,并探讨其在磷胁迫下生长及生理生化特性,旨在对全面认识PmPT3与PmPAP1的功能提供新信息,同时为耐低磷胁迫烟草新种质创制奠定基础,主要结果如下:1.通过农杆菌介导的叶盘法分别将植物表达载体pSH737-35S-PmPT3与pSH737-35S-PmPAP1遗传转化烟草,经PCR鉴定,获得转PmPT3烟草株系30个,转PmPAP1株系25个;半定量RT-PCR及荧光定量qRT-PCR检测转基因植株中外源基因表达表明,PmPT3在16个转基因株系中高表达,PmPAP1在13个转基因株系中高表达。2.对转基因植株及野生型进行不同浓度磷胁迫处理,45 d后检测其生理生化反应。结果表明,低磷胁迫下,转基因烟草保护酶活性较野生型显著提高,而丙二醛含量显著下降;转基因植株无机磷与总磷含量显著高于野生型,根冠比显著提高,表现出较强的耐低磷胁迫能力。说明超表达PmPT3与PmPAP1能显著提高烟草植株在低有效磷环境下磷吸收与利用能力,进而增强植株耐低磷胁迫能力。3.对不同磷处理下转基因烟草中外源基因的表达分析显示,缺磷条件下转基因植株中PmPT3表达量显著提高;对转PmPAP1植株的分析表明,缺磷显著上调根和叶组织中PmPAP1表达,而在高磷胁迫中未检测到PmPAP1表达;酸性磷酸酶活性测定表明,缺磷条件下,转基因植株根系和叶片APase活性均显著高于WT,缺磷诱导转基因植株根和叶PmPAP1上调表达,可能间接提高了植株根系和叶片APase活性,进一步提高植株对介质中磷的吸收能力和体内磷的再利用效率,以适应缺磷环境胁迫。4.过量表达PmPT3对烟草磷转运蛋白Pht1家族基因(NtPT1、NtPT2、NtPT3、NtPT4)的表达影响显示,缺磷显著上调转基因与WT高亲和磷转运蛋白基因(NtPT1、NtPT2、NtPT3)的表达,且转基因烟草中这3个基因的表达量显著高于WT,但NtPT4在二者中的表达无明显差异。5.过表达PmPAP1烟草的内源紫色酸性磷酸酶基因(NtPAPs)表达分析表明,超表达PmPAP1显著促进了NtPAP1的表达;但无论正常供磷或缺磷条件下,NtPAP4,12,19在野生型与转基因植株中的表达几乎一致。