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急性酒精性肝损伤是指短时间内摄入大量酒精,致使血液中酒精浓度超肝脏的代谢能力而引起的肝细胞受损等一系列改变。急性酒精性肝损伤所涉及的分子通路十分复杂,部分研究已经解释了可能参与急性酒精性肝损伤过程的潜在机制,但其在基因表达中的分子机制仍有待阐明。一系列相关的实验研究得出,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在急慢性肝损伤形成过程中起着重要的作用。内质网应激是机体存在的防御保护机制,但应激太强或者持续时间太长,就可能会引起炎症和凋亡等的发生,可引发一系列的病理性改变。然而,ERS参与急慢性肝损伤,尤其是急性酒精性肝损伤的机制尚有待阐明。单次酒精灌胃所诱导的肝损伤是用于研究急性酒精性肝损伤比较常用的方法之一。本研究首先观察了急性酒精性肝损伤模型中合适的内参基因,并进一步研究了内质网应激对外泌体mi R-122表达的影响,主要内容如下:1.急性酒精性肝损伤小鼠模型中内参基因的选择由于单个常见的内参基因不可能在所有条件下都是适用的,所以对于特定的实验设计,不同内参基因的实用性必须经过实验验证。为了更深入研究酒精诱导急性肝损伤的分子机制,选择稳定可靠的内参基因至关重要。1.1 ge Norm,Best Keeper和Norm Finder工具用于评估急性酒精性肝损伤小鼠模型中内参基因表达的稳定性我们采用单次酒精灌胃来构建急性酒精性肝损伤小鼠模型,取同等大小的一小部分肝组织进行HE和TUNEL染色,留取小鼠血液静置离心后获得的血清用于谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)的检测,再称取小鼠的肝重和体重后算得小鼠的肝重系数(肝重/体重)以鉴定建模成功。通过q PCR技术检测肝组织中内参基因(Actb,Gapdh,Gusb,Hprt1,18S,Tbp,B2m)的表达量。使用ge Norm,Norm Finder和Best Keeper工具评估急性酒精性肝损伤小鼠模型中内参基因表达的稳定性。结果发现在酒精诱导的小鼠急性肝损伤模型中Hprt1和Gapdh的组合在急性酒精性肝损伤小鼠模型中被证实为最佳内参基因对,Hprt1表达最稳定。1.2不同内参基因的选择对内质网应激相关基因表达水平的影响在急性酒精性肝损伤小鼠模型中,选择在该模型中表达最稳定基因Hprt1和最不稳定基因18S作为内参基因来检测ERS相关基因(GRP78,CHOP,GRP94,XBP1,XBP1t,ERdj4,PDI)的表达水平。结果显示,与对照组相比,使用Hprt1作为内参基因,酒精12h组肝脏GRP78,CHOP,PDI基因表达水平均显著升高。而使用18S作为内参基因,对照组和酒精组的基因表达水平之间无明显差异。上述结果提示,Hprt1是通过三种内参评估工具选择的可作为小鼠急性酒精性肝损伤模型中合适的内参基因。2.急性酒精性肝损伤小鼠模型中内质网应激对外泌体mi R-122表达的影响外泌体(exosomes)最近成了研究的热点,其为含有脂质双层特征结构的小膜泡。外泌体内含有不同类别的mi RNAs和m RNAs等活性物质,与相近细胞膜融合,将活性物质传递到受体细胞,调节细胞间信号转导,发挥生物学效应。有研究证实外泌体中含有丰富多种mi RNAs,其脂质双层的膜结构可提高mi RNAs的被检测性,能够成为研究mi RNAs可以信赖的载体。在急性酒精性肝损伤中,酒精可直接或间接导致内质网应激的发生。ERS在肝损伤进展过程中起着一定的作用。4-苯基丁酸(PBA)作为ERS抑制剂被广泛应用于研究与内质网应激相关的疾病。研究表明,PBA能够减轻内质网应激以达到降低肝细胞坏死和凋亡的程度的效果。另有研究显示,酒精性肝损伤过程中存在外泌体mi R-122表达水平的上调。因此,本实验进一步研究ERS在急性酒精性肝损伤中对血清外泌体mi R-122表达水平的影响。2.1 4-苯基丁酸对内质网应激的影响为进一步研究ERS在急性酒精性肝损伤中对血清外泌体mi R-122表达水平的影响。我们采用单次酒精灌胃来构建急性酒精性肝损伤的小鼠模型,PBA干预组小鼠在造模前12 h和24 h腹腔注射不同剂量的PBA(75 mg/kg,150 mg/kg),取同等大小的一小部分肝组织进行HE染色,留取小鼠血液离心后获得血清用于ALT的检测,算得小鼠肝重系数鉴定建模成功。Western blot技术检测小鼠肝脏组织中ERS相关蛋白GRP78,p IRE1α和p e IF2α的表达情况。结果显示,PBA能抑制ERS相关蛋白的表达,150 mg/kg剂量的PBA对ERS相关蛋白表达的抑制效果更明显。2.2内质网应激对外泌体mi R-122表达的影响在急性酒精性肝损伤模型组和PBA干预组中,使用Western blot技术检测小鼠肝脏组织中ERS相关蛋白GRP78,p IRE1α和p e IF2α的表达情况,q PCR检测血清外泌体pri-mi R-122,mi R-122表达情况。结果显示,内质网应激可导致外泌体pri-mi R-122,mi R-122表达水平上调,而内质网应激抑制剂PBA可使外泌体pri-mi R-122,mi R-122表达水平下调。上述结果提示,内质网应激可影响外泌体mi R-122的表达。