目的探讨慢性低灌注下小胶质细胞极化对脑白质损伤的作用及其机制。方法第一部分:慢性低灌注脑白质损伤模型的选择与构建成年雄性SD大鼠,随机分为假手术组（SG）、经典双侧颈总动脉结扎组（BG）和改良双侧分期颈总动脉结扎组（GG）,采用经典或改良双侧颈动脉结扎法建立慢性低灌注脑白质损伤大鼠模型;术后3d、4w观察各组死亡率;术后7天观察各组瞳孔对光反射消失情况;4w时采用Kluver-Barrera染色观察脑白质的病理损害;4w时采用水迷宫评估大鼠认知功能损害。第二部分:慢性低灌注脑白质损伤中小胶质细胞表型变化特征成年雄性SD大鼠,随机分为假手术组（SG）和低灌注组（CG）,采用改良分期双侧颈动脉结扎法建立慢性低灌注脑白质损伤大鼠模型;在2w、4w、8w三个时间点,采用Iba-1免疫组化染色,观察胼胝体小胶质细胞活化情况;采用MBP免疫组化染色观察少突胶质细胞和髓鞘损伤情况;采用荧光免疫组化染色双标,标记脑组织Iba-1+CD16双阳性细胞和Iba-1+CD206双阳性细胞,观察在体模型中,脑白质区域M1/M2型小胶质细胞极化的情况;采用western-blot法检测胼胝体IL-1β、IL-6、IL-10三种炎性因子的表达;Kluver-Barrera染色观察脑白质的病理损害;采用水迷宫评估大鼠认知功能损害。第三部分:慢性低灌注脑白质损伤中小胶质细胞表型变化的机制（一）慢性低灌注下A2AR与小胶质细胞表型变化的关系成年雄性SD大鼠,随机分为假手术组（SG）和低灌注组（CG）、A2AR抑制剂组（IG）、A2AR激动剂组（AG）,采用改良分期双侧颈动脉结扎法建立慢性低灌注脑白质损伤大鼠模型;4w采用Kluver-Barrera染色观察脑白质的病理损害;4w时采用水迷宫评估大鼠认知功能损害;用western-blot法检测胼胝体IL-1β、IL-6、IL-10三种炎性因子的表达,检测胼胝体i NOS、Arg 1两种小胶质细胞极化标记物的表达;采用荧光免疫组化染色,标记脑白质中MBP,观察脑白质少突胶质细胞损伤和脱髓鞘的情况;采用荧光免疫组化染色双标,标记脑组织Iba-1+CD16双阳性细胞和Iba-1+CD206双阳性细胞,观察在体模型中,脑白质区域M1/M2型小胶质细胞极化的情况。（二）慢性低灌注下A2AR调控小胶质细胞表型变化的信号通路将少突胶质细胞-小胶质细胞共培养系采用缺氧低糖方法建立慢性低灌注细胞模型,并分别用A2AR激动剂、PKA抑制剂干预,设置对照组（SG）、低灌注组（CG）、A2AR激动剂组（AG）、A2AR激动剂+PKA组抑制剂（AP）。采用Eilsa法检测细胞IL-1β、IL-6、IL-10三种炎性因子的表达,采用Elisa法检测PKA活性,Elisa法检测少突胶质细胞损伤指标检测LDH活性;采用western-blot法检测细胞i NOS、Arg 1两种小胶质细胞极化标记物的表达,检测PKA-CREB信号通路相关分子p-CREB、CREB。在离体模型中,研究A2AR通过PKA-CREB信号通调控小胶质细胞极化的机制。结果第一部分:慢性低灌注脑白质损伤模型的选择与构建术后3d成活率分别为SG组100%,BG组60%,GG组95%;4w成活率为SG组100%,BG组55%,GG组95%。术前瞳孔对光反射消失率三组均为0%,术后7d三组消失率SG组0%,BG组61.5%,GG组0%。Kluver-Barrera染色显示:较SG组,BG组和GG组大鼠脑白质区域均可见神经纤维稀疏、排列紊乱、夹杂空泡样变;BG组和GG组之间无明显差异。水迷宫实验显示,与SG组相比,BG组到达平台潜伏时间延长（P<0.01）,穿平台次数减少（P<0.01）;与BG组相比,GG组在达到平台潜伏时间和穿平台次数上均无显著差异（P>0.05）。第二部分:慢性低灌注脑白质损伤中小胶质细胞表型变化的特征1.Kluver-Barrera染色显示:相比于SG组,CG组脑白质病理损伤加重,出现脱髓鞘、神经纤维紊乱。2.Morris水迷宫认知功能检测:与SG组比较,CG组到达平台的潜伏时间在术后4w、8w时明显延长（P<0.05,P<0.01）,2w时无明显差异;与SG组比较,CG穿越平台次数在术后2w、4w、8w显著减少（P<0.01）。3.免疫组化染色显示慢性低灌注大鼠脑白质区域胶质细胞变化:用Iba-1抗体标记小胶质细胞,Iba-1免疫组化显示SG组、慢性低灌注组2w、4w、8w四组间阳性细胞数差距有统计学意义（P<0.01）。S-N-K检验结果显示,与假手术组,慢性低灌注2w、4w、8w组阳性细胞数值均增加,其中慢性低灌注4w组增加最明显;MBP免疫组化显示假手术组、慢性低灌注组2w、4w、8w四组间IOD值差距有统计学意义（P<0.05）。S-N-K检验结果显示,与假手术组,慢性低灌注2w、4w、8w组IOD值均减少,其中慢性低灌注4w、8w组减少最明显。4.荧光免疫组化双标显示慢性低灌注大鼠脑白质区域胶质细胞极化情况:CD16、Iba-1共标显示,四组间双阳性细胞数差距有统计学意义（P<0.01）。S-N-K检验结果显示,与SG组比较,CG组在2w、4w、8w双阳性细胞均显著增加（P<0.01）,CG组在2w、4w、8w三个时间点之间双阳性细胞无显著差异。荧光免疫组化双标CD206、Iba-1显示,四组间双阳性细胞数差距有统计学意义（P<0.01）。S-N-K检验结果显示,与SG组比较,CG组双阳性细胞在2w增加（P<0.05）;SG组和CG组4w、8w双阳性细胞无显著差异（P>0.05）。5.western-blot检测脑白质炎性因子IL-1β、IL-6和IL-10的表达:与假手术组相比,慢性低灌注组IL-1β在术后2w、4w显著升高（P<0.01）,在8w差异无统计学意义（P>0.05）;与假手术组相比,慢性低灌注组IL-6在术后2w、4w、8w升高（P<0.05）,其中4w显著升高（P<0.01）;与假手术组相比,慢性低灌注组IL-10在术后2w升高（P<0.05）,4w、8w降低（P<0.05）。第三部分:慢性低灌注脑白质损伤中小胶质细胞表型变化的机制（一）慢性低灌注下A2AR与小胶质细胞表型变化的关系Kluver-Barrera染色结果示:与SG组相比,CG组大鼠神经纤维变得疏松,部分纤维排列紊乱,局部出现空泡,且随着慢性低灌注时间的增加,变化更加明显。与CG组相比,IG组经过A2AR抑制剂处理后,神经纤维变得更加疏松,纤维排列紊乱,空泡增加;AG组经过A2AR激动剂处理后,与CG组相比,神经纤维变得紧密,紊乱程度有所降低,空泡减少。结果提示,慢性低灌注引起大鼠脑白质损伤,A2AR激动剂能减轻慢性低灌注后引起的损伤,A2AR抑制剂则能加重慢性低灌注后引起的损伤。Morris水迷宫实验显示:到达平台潜伏时间方面,各组间有统计学差异（P<0.01）,SNK组间比较:与SG组相比,CG组潜伏时间增加（P<0.01）;与CG组相比,AG组潜伏时间减少;穿越平台次数时间方面,各组间有统计学差异（P<0.05）,SNK组间比较:与SG组相比,CG组次数减少（P<0.01）;与CG组相比,AG组次数增加（P<0.05）。western-blot检测脑白质炎性因子IL-1β、IL-6和IL-10的表达:与SG组相比,CG组IL-1β、IL-6显著升高（P<0.01）,IL-10显著降低（P<0.01）;与CG组相比,IG组IL-1β、IL-6显著升高（P<0.01）,IL-10无明显差异（P>0.05）;与CG组相比,AG组IL-1β、IL-6显著降低（P<0.01）,IL-10显著升高（P<0.01）。western-blot检测小胶质细胞极化标记物的表达:与SG组相比,CG组i NOS显著升高（P<0.01）,Arg-1无明显差异（P>0.05）;与CG组相比,IG组i NOS显著升高（P<0.01）,Arg-1无明显差异（P>0.05）;与CG组相比,AG组i NOS显著降低（P<0.01）,Arg-1显著升高（P<0.01）。荧光免疫组化染色显示脑白质区域胶质细胞变化:荧光免疫组化单标MBP显示,与SG组比较,CG组IOD值显著降低（P<0.01）;与CG组比较,IG组IOD值降低（P<0.05）;与CG组比较,AG组IOD值显著升高（P<0.01）。荧光免疫组化双标CD16、Iba-1显示,与SG组比较,CG组双阳性细胞显著增加（P<0.01）;与CG组比较,IG组双阳性细胞增加（P<0.05）;与CG组比较,AG组双阳性细胞显著减少（P<0.01）。荧光免疫组化双标CD206、Iba-1显示,与SG组比较,CG组双阳性细胞无明显差异（P>0.05）;与CG组比较,IG组双阳性细胞无明显差异（P>0.05）;与CG组比较,AG组双阳性细胞显著增加（P<0.01）。（二）慢性低灌注下A2AR调控小胶质细胞表型变化的信号通路Eilsa法检测细胞上清液炎性因子的表达:与SG组相比,CG组IL-1β、IL-6显著升高（P<0.01）,IL-10显著降低（P<0.01）;与CG组相比,AG组IL-1β、IL-6显著降低（P<0.01）,IL-10显著升高（P<0.01）;与AG组相比,AP组IL-1β显著升高（P<0.01）,IL-10显著降低（P<0.01）。Elisa法检测PKA活性:与SG组相比,CG组PKA活性升高（P<0.05）;与CG组相比,AG组PKA活性显著升高（P<0.01）;与AG组相比,AP组PKA活性显著降低（P<0.01）。Elisa法检测少突胶质细胞损伤指标:与SG组相比,CG组显著升高（P<0.01）;与CG组相比,AG组显著降低（P<0.01）;与AG组相比,AP组显著升高（P<0.01）。采用western-blot法检测小胶质细胞极化标记物的表达:与SG组相比,CG组i NOS显著升高（P<0.01）,Arg-1无明显差异（P>0.05）;与CG组相比,AG组i NOS显著降低（P<0.01）,Arg-1显著升高（P<0.01）;与AG组相比,AP组i NOS显著升高（P<0.01）,Arg-1显著降低（P<0.01）。采用western-blot法检测PKA-CREB信号通路相关分子的表达:与SG组相比,CG组p-CREB/CREB升高（P<0.05）;与CG组相比,AG组p-CREB/CREB显著升高（P<0.01）;与AG组相比,AP组p-CREB/CREB显著降低（P<0.01）。结论1.改良大鼠分期双侧颈动脉结扎模型是理想的慢性低灌注脑白质损伤模型;2.慢性低灌注下,大鼠脑白质区域小胶质细胞激活,并向M1表型极化,介导脑白质炎性损伤;3.慢性低灌注下,激活A2AR可使小胶质细胞向M2表型极化,在慢性低灌注脑白质损伤中发挥保护作用;而抑制A2AR则产生相反效应;4.腺苷A2AR通过PKA-CREB信号通路调控小胶质细胞极化,进而调节慢性低灌注脑白质损伤。