老年性痴呆(Alzheimer’s disease, AD)是以进行性学习记忆损伤和情感障碍为特征的老年性中枢神经退行性疾病。Beta淀粉样蛋白(β-amyliod protein, Aβ)沉积为AD大脑内主要病理学特征之一,此外AD脑内存在多条信号通路的转导异常。过量Aβ由其淀粉样肽前体蛋白(βamyloid protein precursor, APP)经α,β,γ-Secretase三种分泌酶代谢紊乱生成。α,β,γ-Secretase活性主要受蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase; JNK)信号通路调控。Aβ则可通过蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)、细胞外信号调节激酶(Extra cellular signal regulated kinase, ERK)、钙调蛋白激酶Ⅱ(calmodulin kinase Ⅱ, CaMKⅡ)三条信号转导通路影响cAMP应答元件结合蛋白(cAMP responsive elements binding protein, CREB)磷酸化,抑制脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)生成,导致神经修复障碍和学习记忆损伤。故抑制Aβ形成以及纠正信号转导通路异常是防治AD的有效干预手段。三七总皂苷(Panax Notoginseng Saponins, PNS)是中药三七的主要有效活性成分。我们前期研究表明,PNS能干预APP基因转录而抑制APP蛋白的表达,并通过调节α,β,γ-Secretase活性最终减少Ap的形成,而产生显著的学习记忆保护作用。本课题继续深入探讨PNS调节α,β,γ-Secretase活性的具体信号通路机制,同时阐明PNS对抗Ap神经毒性获得行为学改善作用的记忆功能相关信号转导通路机制。目的：本研究旨在探讨PNS能否通过干预快速老化痴呆模型小鼠(Senescence Accelerated Mice Prone 8, SAMP8)大脑PKC、JNK信号转导通路,调节脑内α,β,γ-Secretase水平而抑制Aβ蛋白生成,并进一步探讨能否通过干预PKA、ERK、 CaMKⅡ信号转导通路,对抗Ap损伤大脑海马神经所致学习记忆障碍,阐明PNS保护学习记忆损伤的作用机制,以期为开发PNS应用于AD等中枢神经退行性疾病的防治提供基础理论和实验依据。方法：1.本研究采用源自AKR/J系的快速自然老化小鼠SAMP8作为实验动物模型。共60只雄性SAMP8小鼠随机分为模型组(Model group)、PNS低剂量组(L-PNS group)、 PNS高剂量组(H-group)、以及石杉碱甲阳性对照组(Hup-A group),每组15只。PNS低剂量组按100mg/kg体重给药；PNS高剂量组按200mg/kg体重给药；石杉碱甲组按0.3mg/kg体重给药。PNS、石杉碱甲以双蒸水调配后灌胃给药。模型组给予给药组相同容积的双蒸水灌胃。每天灌胃1次,连续给药2个月。2.采用经典MWM水迷宫(Morris Water Maze, MWM)程序(定位航行实验和空间探索实验)检测SAMP8小鼠空间学习记忆功能,中性红尼氏染色对实验动物的大脑海马进行病理学和形态计量学分析,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)双抗体夹心法检测脑内Aβ1-42蛋白水平。探讨PNS对SAMP8小鼠空间学习记忆障碍及Ap生成、海马神经损伤的保护作用。3.运用化学分光光度法直接检测SAMP8小鼠大脑内PKC、JNK1/2/3酶活性,免疫印迹(Western Blotting, WB)检测PKC (cPKC-βⅡ)蛋白、phospho-p46/54 MAPK (p-JNK1/2/3)蛋白表达水平,实时定量RT-PCR (Real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reation, Real-time RT-PCR)技术定量检测PKC (cPKC-βⅠ/ Ⅱ) mRNA、p46 MAPK (JNK1) mRNA水平,探讨PNS对SAMP8小鼠脑内PKC、 JNK信号通路的干预作用。同时采用荧光共振能量转移法(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)检测α,β,γ-Secretase活性,Western Blotting检测ADAM 10 (α-Secretase)、BACE1 (β-Secretase)、Aph-1 (γ-Secretase)蛋白表达水平,Real-time RT-PCR技术定量检测ADAM10、BACE1、Aph-1蛋白mRNA的转录水平,探讨PNS通过调节PKC、JNK信号转导通路干预α,β,γ-Secretase三个关键分泌酶进而抑制Aβ蛋白生成的可能机制。4.运用化学分光光度法检测SAMP8小鼠大脑内PKA、ERK1/2MAPK、CaMKⅡ各蛋白激酶活性,Western Blotting检测PKARIa (PKA调节亚基Iα)蛋白、phospho-p44/42 MAPK (p-ERK1/2)蛋白、p-CaMK Ⅱα/β蛋白表达水平,Real-time RT-PCR定量检测PKARIa mRNA、p42 MAPK (ERK2) mRNA、CaMKⅡαmRNA的水平,探讨PNS对SAMP8小鼠脑内PKA、ERK、CaMKⅡ信号通路的干预作用。同时进一步以Western Blotting检测p-CREB、BDNF蛋白表达水平,Real-time RT-PCR定量检测CREB、BDNF mRNA的水平,探讨PNS通过干预PKA、ERK、CaMKⅡ信号转导通路,影响CREB、BDNF因子转录和蛋白表达水平,对抗Aβ蛋白神经毒性保护学习记忆功能的可能机制。结果：1.PNS对SAMP8小鼠大脑Ap生成、海马神经损伤及空间学习记忆保护作用的研究研究结果表明,PNS能显著降低SAMP8小鼠大脑Aβ1-42水平,减轻海马神经病理损伤,增加海马神经元胞体数量,有效改善SAMP8小鼠所呈现的空间学习记忆障碍。表明PNS具有较好的保护神经损伤和认知功能障碍的作用,此作用可能与其减少Ap生成,降低大脑内Ap水平有关。结果如下：模型组SAMP8小鼠大脑Aβ1-42水平显著高于其他各用药组(P<0.01),PNS高剂量组与石杉碱甲组无显著差异(P>0.05),均明显低于PNS低剂量组。模型组SAMP8小鼠海马神经元胞体数量显著低于其他三组(P<0.01),PNS低、高剂量组显著低于石杉碱甲组(P<0.01),PNS高剂量组显著高于低剂量组(P<0.01)。MWM水迷宫定位航行实验,逃避潜伏期5天总体比较,模型组和PNS低剂量组显著高于PNS高剂量组和石杉碱甲组(P<0.01),模型组和PNS低剂量组无显著差异(P>0.05),PNS高剂量组和石杉碱甲组无显著差异(P>0.05)。平台象限游泳时间百分比的5天总体比较结果显示,各用药组显著高于模型组(P<0.01),PNS低剂量组明显低于PNS高剂量组和石杉碱甲组(P<0.01)。PNS高剂量组和石杉碱甲组无显著差异(P>0.05)。空间探索实验,各组原平台象限游泳时间比较,PNS高剂量组、石杉碱甲组显著高于模型组(P<0.01),低剂量组与模型组无显著性差异(P>0.05)、且与PNS高剂量组、石杉碱甲组亦无显著性差异(P>0.05),高剂量组与石杉碱甲组无显著性差异(P>0.05)。跨越原平台次数比较,PNS高剂量组和石杉碱甲组显著高于模型组(P<0.01),PNS低剂量组高于模型组(P<0.05)、但低于高剂量组(P<0.05)和石杉碱甲组(P<0.01),高剂量组和石杉碱甲组无显著差异(P>0.05)。2.PNS减少SAMP8小鼠大脑Ap生成的相关信号转导通路作用机制研究研究结果表明,PNS能显著提高SAMP8小鼠大脑cPKC-βⅠ/Ⅱ mRNA、cPKC-βⅡ蛋白以及PKC酶活性水平,同时增强ADAM10 mRNA、ADAM10蛋白表达以及α-Secretase的活性,抑制BACE1 mRNA、BACE1蛋白表达以及β-Secretase活性。此外,结果显示PNS还显著降低p46 MAPK(JNK1)mRNA、phospho-p46 MAPK(p-JNK1)蛋白表达及JNK1酶活性,抑制Aph-1 mRNA、Aph-1蛋白表达以及γ-Secretase活性。提示PNS可通过促进PKC信号通路活化,增强α-Secretase并抑制β-Secretase的活性与表达,同时通过抑制JNK信号通路抑制γ-Secretase的活性与表达,最终减少Aβ蛋白生成。结果如下：模型组PKC活性明显低于PNS高剂量与石杉碱甲组(P<0.01),模型组与PNS低剂量组比较无显著差异(P>0.05)。石杉碱甲组与PNS高剂量组之间比较无显著差异(P>0.05)。模型组典型PKC (classicalor conventional PKC,cPKC) beta Ⅰ/Ⅱ亚类(cPKC-βⅠ/Ⅱ) mRNA水平明显低于其他各组(P<0.01),PNS高剂量与石杉碱甲组间无显著差异(P>0.05)。石杉碱甲组与PNS高剂量组beta Ⅱ亚类cPKC (cPKC-βⅡ)蛋白表达量明显高于模型组和PNS低剂量组(P<0.01),石杉碱甲组与PNS高剂量组之间无明显差异(P>0.05),模型组和PNS低剂量组比较无明显差异(P>0.05)。模型组JNK1酶活性明显高于PNS高剂量组和石杉碱甲组(P<0.01),低剂量组与模型组无显著差异(P>0.05),PNS高剂量组与石杉碱甲组无显著差异(P>0.05)。JNK2、JNK3在四组间两两比较均无显著差异(P>0.05)。模型组p46 MAPK (JNK1) mRNA水平显著高于其他各组(P<0.01),PNS低剂量组显著高于PNS高剂量与石杉碱甲组(P<0.01),PNS高剂量与石杉碱甲组间无显著差异(P>0.05)。模型组phospho-p46 MAPK (p-JNK1)蛋白表达水平明显高于其他各组(P<0.01),石杉碱甲组、PNS高剂量组、PNS低剂量组之间无明显差异(P>0.05)。模型组a-Secretase活性显著低于PNS高剂量组和石杉碱甲组(P<0.01),p-Secretase、γ-Secretase活性显著高于其他各组(P<0.01),PNS高剂量组和石杉碱甲组两组间无显著差异(P>0.05)。模型组ADAM 10 mRNA水平显著低于PNS高剂量组和石杉碱甲组(P<0.01),PNS低剂量组与模型组无明显差异(P>0.05),高剂量组和石杉碱甲组无明显差异(P>0.05)。模型组BACE1 mRNA水平显著高于PNS低剂量组(P<0.05)、以及PNS高剂量组和石杉碱甲组(P<0.01), PNS、低高剂量组显著高于石杉碱甲组(P<0.05)。模型组Aph-1 mRNA水平显著高于其他各组(P<0.01),PNS高剂量组和石杉碱甲组无明显差异(P>0.05)。石杉碱甲组与PNS高剂量组ADAM10蛋白表达量明显高于模型组和PNS低剂量组(P<0.01),石杉碱甲组高于PNS高剂量组(P<0.01),模型组和PNS低剂量组比较无明显差异(P>0.05)。石杉碱甲组与PNS高剂量组BACE1、Aph-1蛋白表达量明显低于模型组和PNS低剂量组(P<0.01),石杉碱甲组与PNS高剂量组之间无明显差异(P>0.05),模型组和PNS低剂量组比较无明显差异(P>0.05)。3.PNS抗Ap损伤大脑海马神经保护学习记忆功能的相关信号转导通路机制研究研究结果显示,PNS能显著提高SAMP8小鼠大脑PKA、ERK1/2 MAPK. CaMKⅡ各蛋白激酶的活性,增加PKARIα、p-ERK2、CaMK Ⅱ α mRNA转录和蛋白表达水平,且同时提高脑内p-CREB、BDNF因子mRNA转录和蛋白表达水平。提示PNS可通过干预PKA、ERK、CaMK Ⅱ信号转导通路,活化CREB,促进BDNF合成,有效保护Ap蛋白诱导的神经损伤和认知损害。结果如下：模型组PKA活性显著低于PNS低剂量组(P<0.05)和PNS高剂量和石杉碱甲组(P<0.01),PNS低剂量组显著低于PNS高剂量和石杉碱甲组(P<0.01),PNS高剂量组和石杉碱甲组比较无显著差异(P>0.05)。模型组PKARIa(PKA调节亚基RIα)mRNA水平显著降低,PNS高剂量与石杉碱甲组显著高于模型组(P<0.01),PNS高剂量与石杉碱甲组间无显著差异(P>0.05),PNS低剂量组与模型组间无显著差异(P>0.05)。石杉碱甲组与PNS高剂量组PKARIa蛋白表达量明显高于模型组和低剂量组(P<0.01),石杉碱甲组与PNS高剂量组之间无明显差异(P>0.05),模型组和低剂量组比较无明显差异(P>0.05)。模型组ERK1/2 MAPK酶特异活性显著低于其他各组(P<0.01),PNS高、低剂量组、石杉碱甲组两两比较无显著差异(P>0.05)。模型组p42 MAPK (ERK2) mRNA水平显著低于其他各组(P<0.01),PNS低剂量组低于PNS高剂量(P<0.01)与石杉碱甲组(P<0.05)。PNS高剂量与石杉碱甲组间无显著差异(P>0.05)。模型组phospho-p44/42 MAPK (p-ERK1/2)蛋白表达水平显著低于其他各组(P<0.01),石杉碱甲组明显高于PNS低剂量组(P<0.01)和PNS高剂量组(P<0.05),PNS高剂量组明显高于PNS低剂量组(P<0.01)。CaMKⅡ酶活性比较,模型组显著低于其他各组(P<0.01),PNS低剂量组低于高剂量和石杉碱甲组(P<0.01),PNS高剂量与石杉碱甲组无显著差异(P>0.05)。模型组CaMKⅡa mRNA水平最低,与其他各组差异显著(P<0.01),PNS高剂量与石杉碱甲组较PNS低剂量组更高(P<0.01),PNS高剂量与石杉碱甲组间无显著差异(P>0.05)。石杉碱甲组与PNS高剂量组p-CaMK Ⅱα/β蛋白表达量明显高于模型组和低剂量组(P<0.01),石杉碱甲组高于PNS高剂量组(P<0.01),模型组和低剂量组比较无明显差异(P>0.05)。模型组CREB mRNA水平明显低于其他各组(P<0.01)。PNS低剂量组低于PNS高剂量与石杉碱甲组较高(P<0.01)。PNS高剂量与石杉碱甲组间无显著差异(P>0.05)。模型组p-CREB蛋白水平明显低于PNS高剂量组(P<0.01)和石杉碱甲组(P<0.05),PNS低剂量组和模型组比较无明显差异(P>0.05),石杉碱甲组与PNS高剂量组之间无明显差异(P>0.05)。模型组BDNF mRNA水平显著低于其他各组(P<0.01),PNS低剂量组低于PNS高剂量与石杉碱甲组(P<0.01),PNS高剂量与石杉碱甲组间无显著差异(P>0.05)。石杉碱甲组与PNS高剂量组BDNF蛋白水平明显高于模型组和低剂量组(P<0.01),石杉碱甲组与PNS高剂量组之间无明显差异(P>0.05),模型组和低剂量组比较无明显差异(P>0.05)。结论：1.PNS具有保护大脑海马神经损伤,改善SAMP8小鼠空间学习记忆障碍作用,该作用与其减少Ap蛋白生成,以及抗Ap蛋白神经毒性密切相关。2.PNS能增强SAMP8小鼠大脑α-Secretase基因与蛋白表达和活化,是其减少Aβ蛋白生成的主要机制之一,该作用与PNS能促进α-Secretase相关的PKC信号转导通路活化密切相关。3.PNS能抑制SAMP8小鼠大脑β-Secretase基因与蛋白表达和活化,是其减少Ap蛋白生成的主要机制之二,该作用与PNS能促进β-Secretase相关的PKC信号转导通路活化密切相关。4.PNS能抑制SAMP8小鼠大脑γ-Secretase基因与蛋白表达和活化,是其减少Aβ蛋白生成的机制之三,该作用与PNS能抑制γ-Secretase相关的JNK信号通路转导密切相关。5.PNS能增强p-CREB、BDNF因子基因与蛋白的表达,是PNS保护大脑海马神经损伤的重要机制之一,也是PNS保护大脑长时程增强(Long-term potentiation, LTP)受损,改善学习记忆障碍的重要机理。6.PNS增强p-CREB、BDNF因子基因与蛋白的表达,与其促进相关的上游信号通路PKA、ERK、CaMKⅡ通路活化密切相关。7.PNS抗Aβ蛋白神经毒性作用,与其促进记忆功能相关的PKA、ERK、CaMKⅡ信号通路活化,增强p-CREB、BDNF因子基因与蛋白的表达密切相关。8.PNS具有同时作用于多个信号转导通路,调节下游相关蛋白表达的多靶位作用机制,这可能是PNS防治AD等致病因素复杂的神经退行性疾病的优点。