根癌农杆菌介导的Expansin基因转化烟草的研究

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Expansin是近年来发现的迄今惟一能诱导热钝化的离体细胞壁伸展的细胞壁特异性蛋白质。Expansin在控制植物细胞生长方面,能调节细胞壁的膨胀。可以通过生长素调控,引起pH下降,激活相关水解酶,引起木葡聚糖或β-葡聚糖等半纤维素的降解,打断半纤维素与纤维素微纤丝之间的氢键,改变细胞壁的承重网络,从而加速生长。如果将Expansin基因转入杨树、桉树等重要林木,则可以提高林木的生长速率,加速成材,具有很大的应用前景及经济价值。烟草是最早也是最多应用于分子生物学和基因工程研究的模式植物之一。本实验通过农杆菌菌介导法用含有抗卡那霉素的npt 11基因的双元载体将Expansin基因导入到烟草叶外植体中,然后在含有卡那霉素的选择培养基上进行筛选培养,并经过PCR检测,获得了一批烟草转基因植株。其实验结果如下: 1.高效植株再生体系的建立 (1) 芽的诱导 经比较确定14-18d苗龄烟草的叶片为再生能力较强的外植体,以MS为基本培养基,从设计的一系列培养基中按效果筛选出MS+6.BA 0.5mg/L为诱导芽分化的培养基,出芽多,叶外植体平均出芽数为8.7个;生长快,7d左右即可诱导出芽来。 (2) 芽的生根 以1/2MS培养基为基本培养基,从设计的一系列培养基中按效果筛选出1/2MS+IAA 0.1mg/L为芽的生根培养,生根率达100%,根系发达,呈辐射状。 本实验基本上建立了高效烟草植株再生体系,为更多外源目的基因的导入奠定了基础。 2.烟草遗传转化体系的建立 (1)卡那霉素筛选浓度的确定 由于所构建的植物表达载体携带有新霉素磷酸转移酶(npt Ⅱ)基因,因此以Kan为筛选试剂选择转化细胞。烟草叶片外植体在Kan 25mg/L的培养基上能正常分化出芽,可保持绿色,与在0mg/L的培养基上无明显差异;
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