随着对白血病认识的不断深入，白血病的诊断、治疗和预后等水平也不断提高。儿童及成人急性淋巴细胞白血病（ALL）的5年无病生存（DFS）率分别达75％及35％甚至更高，急性髓细胞白血病（AML）的完全缓解（CR）率和5年DFS率分别为60％～70％和30％，其中急性早幼粒细胞白血病（APL）的CR率达85％。但是，目前仍有部分经治疗后获得完全缓解的患者在数年之内复发。 通过前期研究，已分别构建了含BCR-ABL M-bcr、BCR-ABL m-bcr、BCR-ABLμ-bcr、PML-RARα、AML1-ETO、TEL-AML1、CBFβ-MYH11、E2A-PBX1和MLL-AF4等9种白血病相关融合基因的重组质粒，以及含ABL内参基因的重组质粒，并建立了其FQ-PCR检测的标准曲线及标准方程。本研究的目的，是在上述前期研究的基础上，以K562细胞（含BCR-ABL融合基因）、REH细胞（含TEL-AML1融合基因）、NB4细胞（含PML-RARα融合基因）和KASUMI-1细胞（含AML1-ETO融合基因）等4种细胞为阳性细胞，以HL-60细胞系（不含上述白血病相关融合基因）作为阴性细胞，以含BCR-ABL M-bcr、PML-RARα、AML-ETO和TEL-AML1等4种白血病相关融合基因的重组质粒为标准品，以FQ-PCR方法检测阳性细胞中BCR-ABL M-bcr、TEL-AML1、PML-RARα和AML1-ETO等4种白血病融合基因的表达量，并通过对检测结果进行室内质量控制和误差分析，以及真实性和可靠性的判断，对FQ-PCR检测白血病融合基因进行方法学的评价。在此基础上，应用FQ-PCR检测初诊白血病患儿的相关融合基因，并在治疗过程中对融合基因的表达量进行初步追踪观察，为临床应用FQ-PCR监测白血病MRD奠定基础。 研究目的: 1.通过细胞水平的研究，对FQ-PCR定量检测白血病融合基因进行全面的方法学评价。 2.以FQ-PCR定量检测初诊白血病患儿的相关融合基因，对阳性者，追踪观察其在白血病治疗过程中的变化，为进一步临床研究奠定基础。 研究内容: 1.选取K562细胞（含BCR-ABL融合基因）、REH细胞（含TEL-AML1融合基因）、NB4细胞（含PML-RARα融合基因）和KASUMI-1细胞（含AML1-ETO融合基因）作为阳性细胞，以HL-60细胞（不含上述白血病相关融合基因）作为阴性细胞，将上述4种细胞分别梯度稀释为1：100～1：1056个浓度，以FQ-PCR检测相应融合基因的相对表达量。 2.根据上述检测结果，通过计算SI值、灵敏度和变异系数（CV），对实验研究进行室内质量控制和误差控制的分析。 3.通过计算敏感性、特异性、约登指数和CV，判断检测方法的真实性和可靠性。 4.以FQ-PCR检测初诊白血病患儿的相关融合基因，阳性者，在治疗过程中继续追踪观察相关融合基因表达量的变化。 研究方法: 1.细胞水平的研究 （1）培养K562细胞、REH细胞、NB4细胞和KASUMI-1细胞。 （2）用HL-60细胞作为阴性细胞梯度稀释上述4种细胞，其稀释浓度为1：100～1：105。 （3）提取上述细胞RNA，并逆转录为cDNA。 （4）以含BCR-ABL M-bcr、PML-RARα、AML1-ETO和TEL-AML1等4种白血病相关融合基因的重组质粒为标准品，通过FQ-PCR建立标准曲线和标准方程。以FQ-PCR检测待检细胞的BCR-ABL M-bcr、PML-RARα、AML1-ETO和TEL-AML1等4种融合基因，通过质粒标准品的标准曲线及标准方程得出融合基因的相对表达量（融合基因拷贝数与内参基因拷贝数之比），以NCN表示。 （5）上述实验每组设3个复管，连续3天重复实验，即每种细胞每一浓度可获得9个实验数据。从第三次实验开始进行“即刻法”质控，直至第九次实验结束。根据实验结果计算SI值、批内CV、批间CV和灵敏度，进行室内质量控制和误差控制的分析。 （6）计算敏感性、特异性、约登指数、批内CV和批间CV，评价检测方法的真实性和可靠性。 2.临床观察 （1）采集经骨髓细胞形态、免疫分型确诊的初诊白血病患儿骨髓并抽提RNA，制备cDNA。 （2）FQ-PCR定量检测7种白血病相关融合基因。 （3）白血病相关融合基因阳性者，于诱导缓解治疗后追踪融合基因表达量的变化。 研究结果: 1.质粒标准品经FQ-PCR检测后，生成标准曲线、标准方程、相关系数r2及扩增效率（见表4）。 2.FQ-PCR检测白血病融合基因的结果显示：①当细胞浓度在1：100～1：105范围时，细胞浓度与待检融合基因的Ct值呈负相关；②细胞浓度每下降1个对数级，0.985～0.986之间，P<0.001，呈高度正相关；③内参基因的Ct值在21.86±0.05～26.48±0.73范围之间。 3.每种细胞每一浓度的第九次实验结束后，其NCN的SI上限值和SI下限值均小于Q2s。 4.FQ-PCR检测4种细胞系相关融合基因的灵敏度均为10-5。 5.FQ-PCR检测白血病融合基因，敏感度以TEL-AML1和AML1-ETO最高（100％），BCR-ABL M-bcr次之（97.92％），PML-RARα最低（89.58％）；TEL-AML1、PML-RARa和AML1-ETO的特异度一致（93.75％），BCR-ABL M-bcr的特异度较低（81.25％）；约登指数以TEL-AML1和AML1-ETO最接近理想（0.94），PML-RARα次之（0.83），BCR-ABL M-bcr最小（0.79）。 6.在被检的4种融合基因中，KASUMI-1细胞浓度为1：100～1：105时，其AML1-ETO融合基因NCN值的批内CV和批间CV均小于3％，可靠性最好；K562、REH和NB4细胞浓度为1：100～1：103时，其相关融合基因NCN值的批内CV和批问0CV均小于10％，可靠性较好，在细胞浓度为1：104～1：105时，其相关融合基因NCN值的批内CV小于6％，可靠性也较好，而批间CV则小于30％，可靠性逊于上述。 7.收集初诊白血病标本56例，FQ-PCR检测初诊白血病患者融合基因的检出率为28.57％，其中初诊ALL的检出率为15.38％，AML的检出率为14.29％，APL和CML的检出率均为100.00％。 8.对6例APL患儿予诱导缓解化疗，2例CML患儿予格列卫治疗，取得CR后继续以FQ-PCR追踪PML-RARα和BCR-ABL融合基因的NCN值，结果见表11和表12。 结论: 1.每种白血病细胞稀释为1：100～1：1056个浓度，每一浓度设3个复管，连续检测3天，所获得的全部数据均在可控范围内。 2.细胞浓度每下降1个对数级，其待检融合基因的NCN值相应下降0.5～1个对数级，两者之间的相关系数r2在0.985～0.986之间，P<0.001，呈高度正相关性。 3.FQ-PCR检测白血病融合基因的灵敏度为10-5，与国外文献报道一致。 4.FQ-PCR检测白血病融合基因，敏感度以TEL-AML1和AML1-ETO最高，为100％，BCR-ABL M-bcr次之（97.92％），PML-RARα最低（89.58％）；TEL-AML1、PML-RARα和AML1-ETO的特异度一致（93.75％），BCR-ABL M-bcr的特异度较低（81.25％）；约登指数以TEL-AML1和AML1-ETO最接近理想（0.94），PML-RARα次之（0.83），BCR-ABL M-bcr最小（0.79）。 5.当KASUMI-1细胞浓度在1：100～1：105范围时，FQ-PCR检测AML1-ETO融合基因的NCN值的批内CV和批间CV均小于3％，可靠性和精密度最好：K562、REH和NB4细胞浓度为1：100～1：103时，FQ-PCR检测BCR-ABL M-bcr、TEL-AML1和PML-RARα的NCN值的批内CV和批问CV均小于10％，可靠性和精密度较好，在细胞浓度为1：104～1：105时，上述相关融合基因NCN值的批内CV小于6％，可靠性和精密度也较好，而批间CV小于30％，但仍在可控范围之内。 6.收集56例初诊白血病患儿的骨髓标本，FQ-PCR检测初诊白血病患者融合基因的检出率为28.57％，其中初诊ALL的检出率为15.38％，AML的检出率为14.29％，APL和CML的检出率均为100.00％。初步追踪观察融合基因水平变化与治疗反应一致。