论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine Reproductive and Respiration Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。PRRSV基因组中的ORF2～7基因分别编码病毒的GP2、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白。其中N蛋白免疫原性最强,为本病毒的优势结构蛋白,而且在病毒粒子中含量最多,为诊断PRRS的首选蛋白。本试验将PRRSV在Marc-145细胞上培养,收获病毒液,经高速离心得到了纯化的PRRSV,通过紫外可见分光光度计测定其蛋白含量为1.35mg/mL。将浓缩纯化病毒灭活,通过棋盘法确定抗原的最佳包被含量为2.438μg/mL,同时优化各步反应条件,建立了可以检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。将纯化的PRRSV与等量弗氏佐剂乳化,按110μg/只的剂量经皮下免疫接种BALB/C小鼠,每隔2周1次,共5次,待血清抗体效价达到1:6400以上后,再腹腔注射330μg纯抗原进行超强免疫。3天后无菌取小鼠脾脏,制备脾细胞,将其按5:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合,待融合细胞铺满孔底1/3时,用建立的间接ELISA方法检测,筛选阳性克隆细胞株。用有限稀释法将阳性克隆细胞株进行亚克隆,经SDS-PAGE和Western blot鉴定得到了两株能稳定分泌抗N蛋白的抗体的阳性克隆细胞株,分别命名为AD10和BC12。阳性克隆细胞株经扩大培养后,取约含4～6×106个细胞的细胞悬液注入小鼠腹腔,12天后收取腹水,应用建立的间接ELISA方法测定,抗体效价为1:160。将纯化PRRSV抗原分成两部分,一部分用甲醛处理,另一部分不用甲醛处理,分别与等量弗氏佐剂乳化后制备成免疫抗原。将20只小鼠随机分成A、B、C、D四组,每组5只,按110μg/只的剂量经皮下免疫接种小鼠,A组和B组分别用处理和未处理抗原各免疫1次,C组和D组分别用处理和未处理抗原各免疫2次,间隔7天1次。免疫后每隔7天进行一次尾静脉采血,分别用可以检测抗PRRSV,GP5、M和N蛋白抗体的间接ELISA方法检测。结果表明4个试验组的免疫小鼠都可以产生针对PRRSV及各结构蛋白的抗体,抗N蛋白的抗体产生最早,免疫后14天出现,21天后抗体效价达到1:1280;抗M蛋白的抗体在免疫后42天出现,抗体效价达到1:80,抗GP5蛋白的抗体在免疫后49天出现,抗体效价达到1:80。二次免疫比一次免疫抗体效价总体略微偏高,用甲醛处理的病毒免疫而产生的抗体效价略微偏高。同时将每次采集的小鼠血清按1:2、1:4和1:8倍比稀释后做细胞中和试验,结果表明4个试验组免疫小鼠血清仅在免疫后42天检测到中和抗体,抗体效价为1:2,结果表明PRRSV免疫原性较弱,对于机体不能产生有效的保护。