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肾细胞癌是泌尿系统第二大恶性肿瘤，约占成人肿瘤的2%-3%。肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是最常见的肾细胞癌亚型。目前对于有转移或者术后复发的ccRCC患者缺乏行之有效的治疗手段。因此，需要进一步了解ccRCC的发生、发展机制，探索新的有效的治疗靶点。
内质网蛋白57(Endoplasmic reticulum protein 57，ERp57)为内质网(endoplasmic reticulum，ER)腔糖蛋白特异性硫醇氧化还原酶，在内质网的糖蛋白折叠过程中促进分子内和分子间二硫键的形成以及折叠反应。研究证实，ERp57可以在细胞因子刺激或者应激状态下从细胞质转移至细胞核，通过与信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)相互作用而增强STAT3的转录活性。此外，ERp57在多种肿瘤中异常失调，影响下游基因DKC1、EGFR等的表达，从而影响细胞的增殖，参与多种肿瘤的进展及转移，并与不良预后相关，但ERp57在ccRCC中的表达及作用尚不清楚。
白细胞介素增强子结合因子3(Interleukin enhancer-binding factor 3, ILF3)，是一种双链RNA(dsRNA)结合蛋白。ILF3可与其他蛋白质、dsRNA、小非编码RNA或mRNA形成复合物，从而调节基因表达或稳定mRNA。研究表明ILF3具有促进肿瘤细胞增殖的作用，敲低ILF3能通过降低相应mRNA的稳定性进而使得细胞周期停滞及抑制细胞增殖。然而ILF3在ccRCC中的作用尚未充分阐明。
目的：本研究拟以人体肾透明细胞癌组织、人肾透明细胞癌细胞株和裸鼠肾透明细胞癌模型作为研究对象，应用免疫组织化学及多种分子生物学方法，观察ERp57、ILF3以及STAT3在ccRCC中的表达，探索三者在ccRCC发生发展中的作用及相互关系，以期为临床上寻找ccRCC治疗新靶点提供理论依据。
方法：
1.收集35例ccRCC患者肿瘤组织和癌旁组织，HE染色常规观察。免疫组织化学、Westernblot及qRT-PCR检测ERp57、ILF3在ccRCC癌组织与癌旁组织的表达水平。
2.通过癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库分析了ccRCC组织与癌旁组织中ERp57、ILF3的表达以及对ccRCC患者总体生存率的影响。
3.MTT法检测敲低或过表达ERp57对ccRCC细胞增殖能力的影响。
4.克隆形成实验检测在SW839细胞中敲低ERp57或过表达ILF3、A498细胞中过表达ERp57或敲低ILF3的ccRCC细胞增殖能力。同时检测在SW839细胞中联合敲低ERp57与过表达ILF3、联合敲低ERp57与STAT3，在A498细胞中联合过表达ERp57与敲低ILF3、联合过表达ERp57与敲低STAT3对ccRCC细胞增殖能力的影响。
5.Brdu染色检测ccRCC细胞中敲低ERp57、STAT3及ILF3，或联合敲低STAT3及ILF3、STAT3及ERp57时的细胞增殖情况。
6.Transwell迁移实验测定敲低或过表达ERp57对ccRCC细胞迁移能力的影响。
7.免疫双荧光染色检测ccRCC组织中ERp57与ILF3的细胞定位。
8.应用放线菌素D(ActD)阻止转录后，使用qRT-PCR分析来测量在SW839细胞中敲低ILF3或A498细胞中过表达ILF3对ERp57mRNA水平随时间变化的影响。
9.ccRCC细胞中敲低或过表达ILF3并给与STAT3抑制剂氯硝柳胺处理，Westernblot检测STAT3、p-STAT3和CyclinE1的表达情况。
10.Westernblot和实时定量PCR(qRT-PCR)测量ERp57、ILF3、STAT3、CyclinE1、CyclinD1蛋白质以及mRNA在ccRCC组织以及细胞中的表达。
11.免疫共沉淀(CoIP)检测ERp57与STAT3之间的蛋白质-蛋白质相互作用。
12.染色质免疫共沉淀(ChIP )和启动子荧光素酶报告基因证明STAT3-ERp57复合物与ILF3启动子的结合及对ILF3的转录水平调控作用。
13.RNA免疫共沉淀(RIP)和RNA生物素下拉实验检测ILF3与ERp57mRNA的相互作用。
14.构建稳定敲低ERp57、ILF3以及联合敲低ERp57和ILF3的ccRCC细胞株，并构建裸鼠移殖瘤模型，Westernblot检测异种移殖肿瘤p-STAT3、ERp57、ILF3、CyclinE1以及Cleavedcaspase-3的表达。BrdU染色检测异种移植肿瘤细胞增殖能力。
结果：
1.ERp57在ccRCC组织中的表达
1.1ERp57在ccRCC组织中的表达及与预后的关系
qRT-PCR、Westernblot及免疫组织化学结果表明，与癌旁组织相比，ccRCC组织中ERp57的mRNA和蛋白质水平均异常升高。分析ERp57的mRNA表达水平与患者临床病理特征的关系发现，ERp57的mRNA表达水平与肿瘤大小呈正相关。进而，应用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库分析了ccRCC肿瘤组织ERp57的表达水平及与患者总体生存率的关系，结果显示，ccRCC肿瘤组织中的ERp57mRNA水平比癌旁肾脏组织明显增高，且ERp57表达高的ccRCC患者总体预后不良。
1.2ERp57与ccRCC细胞的增殖和转移的相关性
qRT-PCR结果显示，6种不同的ccRCC细胞系中，ERp57在A498细胞中表达最低，在SW839细胞中表达最高。MTT及克隆形成实验结果显示，与空载体相比，A498细胞ERp57的过表达促进细胞的增殖，而敲低ERp57则抑制SW839细胞的增殖。此外，Transwell迁移实验表明，ERp57的过表达诱导A498细胞迁移，敲低SW839细胞中的ERp57导致细胞迁移能力显著降低。
2.ERp57与ILF3在ccRCC组织中的调控关系
选择之前报道的受ERp57调控且与细胞增殖相关的基因ILF3。免疫双荧光结果同时表明，在ccRCC组织中，ERp57定位于细胞浆中，ILF3定位于细胞核中，二者在ccRCC组织中同时增高。
qRT-PCR及Westernblot结果显示，过表达ERp57促进ccRCC细胞中ILF3的表达，而敲低ERp57抑制ccRCC细胞中ILF3表达。另外，qRT-PCR、Westernblot和IHC结果显示与癌旁肾脏组织相比，ccRCC组织中的ILF3mRNA及蛋白表达水平明显更高。同时通过TCGA数据库分析结果也证实ILF3在ccRCC组织中表达更高，且高表达ILF3的ccRCC患者总体预后不良。进一步分析ILF3表达与ccRCC患者的临床特征，结果显示ILF3mRNA水平的升高与肿瘤瘤体增大显著相关。相关性分析发现在ccRCC组织中，ERp57与ILF3呈正相关。
3.ERp57/STAT3/ILF3在ccRCC细胞中的相互作用
3.1STAT3介导ERp57对ILF3的调控
Westernblot及qRT-PCR结果表明，与单独敲低ERp57或STAT3相比，在SW839细胞联合敲低STAT3及ERp57的表达均可显著降低ccRCC细胞的ILF3蛋白及mRNA表达水平，在A498细胞中同时敲低STAT3而过表达ERp57仍然导致ILF3蛋白及mRNA水平的降低，但在一定程度上逆转了降低的程度，说明STAT3介导ERp57对ILF3的调控。BrdU免疫组织化学显示，仅敲低STAT3或ERp57即可抑制细胞增殖，联合敲低STAT3和ERp57则进一步增强这种抑制作用。
3.2ERp57/STAT3复合物转录水平调控ILF3表达
免疫共沉淀(CoIP)进一步证实了STAT3和ERp57之间存在蛋白质-蛋白质相互作用。ChIP-qPCR分析结果显示STAT3和ERp57蛋白可以与ILF3启动子区相结合。荧光素酶报告基因分析法发现ERp57的过表达明显增加了ILF3启动子中存在的荧光素酶载体的活性。但是，内源性STAT3敲低并转染ERp57过表达载体后，荧光素酶活性保持不变。这表明STAT3与ILF3启动子直接交联，调节ILF3转录。
3.3ILF3在ccRCC中调节ccRCC细胞ERp57的表达
qRT-PCR结果发现ILF3的过表达升高了ccRCC细胞中ERp57mRNA的水平，而敲低ILF3则降低了ccRCC细胞中ERp57mRNA的水平。应用放线菌素D(ActD)阻止转录后，使用qRT-PCR分析来测量ERp57mRNA水平随时间的变化。发现，ILF3敲低抑制了ActD对ERp57mRNA稳定性的作用，ILF3的过表达促进了ActD对ERp57mRNA稳定性的作用。CoIP结果表明，ILF3抗体可以下拉足够水平的内源性ILF3蛋白。继而通过RIP分析表明，在被ILF3抗体下拉的蛋白质-RNA复合物中存在CyclinE1和ERp57mRNA3UTR。同样地，Biotin-oligopulldown也显示，ERp57mRNA-3UTR和阳性对照CyclinE1mRNA探针的沉淀物中含有ILF3蛋白。这些结果表明ILF3可以结合ERp57mRNA3UTR并增强其mRNA稳定性。
克隆形成实验结果表明，ILF3的过表达促进了ccRCC细胞的增殖，而ILF3的敲低耗尽则导致ccRCC细胞增殖减少。此外，ILF3的过表达与ERp57的敲低相结合，逆转了ILF3过表达诱导的细胞增殖的增加以及ERp57敲低导致的细胞增殖的减少。并且，ERp57的过表达与ILF3的敲低相结合，减弱了由于ILF3敲低引起的细胞增殖减少以及ERp57过表达引起的细胞增殖增加。这些发现支持ILF3通过促进ERp57mRNA稳定性来参与ccRCC细胞增殖的调节。
3.4ILF3/ERp57/STAT3反馈回路在ccRCC细胞增殖中的作用
Westernblot结果显示应用STAT3抑制剂氯硝柳胺处理SW839和A498细胞，发现磷酸化的STAT3(p-STAT3)、CyclinE1和ILF3的水平降低，但对总STAT3蛋白水平没有影响。而这种对p-STAT3的抑制作用可以通过同时敲低SW839细胞中的ILF3来增强，而通过在A498细胞中过表达ILF3来逆转。BrdU染色以及克隆形成试验结果表明，抑制STAT3或ILF3可以减少SW839细胞的增殖，而同时抑制STAT3及ILF3导致SW839细胞增殖进一步减少。SW839细胞中同时转染shSTAT3和shERp57可增强ccRCC细胞生长的抑制作用，而ERp57的过表达则可以逆转STAT3敲低导致的A498细胞生长抑制。
4.体内实验中，ILF3/ERp57/STAT3通路在ccRCC细胞增殖中的作用
将具有稳定敲低的ERp57或ILF3或ERp57与ILF3联合敲低的SW839细胞植入裸鼠。与载体对照组相比，shERp57和shILF3组的肿瘤体积明显缩小。此外，与植入单独敲低ERp57或ILF3的小鼠相比，植入联合敲低ERp57和ILF3的SW839细胞的小鼠肿瘤体积及平均湿重明显更低。Westernblot分析表明，单独敲低ERp57或ILF3会显著下调p-STAT3，ERp57，ILF3和CyclinE1的水平，并且与载体对照组相比，裂解的caspase-3表达增加。通过联合敲低ERp57和ILF3可以增强这些作用。BrdU染色表明，敲低ERp57或ILF3抑制肿瘤细胞的增殖，联合敲低ERp57和ILF3抑制增殖作用进一步增强。
结论：
1.ERp57及ILF3在肾透明细胞癌细胞均呈过表达，且ERp57、ILF3的高水平表达与患者的不良预后有关。
2.ILF3与ERp57结合并通过增强其mRNA稳定性正向调节ERp57的表达。
3.ERp57的异常表达通过启动与ccRCC患者预后相关的STAT3/ILF3反馈环促进ccRCC细胞的增殖进展。这些结果为ERp57/STAT3/ILF3反馈回路参与ccRCC肿瘤细胞代谢的调控提供了有力的证据，有可能成为ccRCC的潜在治疗靶点。
内质网蛋白57(Endoplasmic reticulum protein 57，ERp57)为内质网(endoplasmic reticulum，ER)腔糖蛋白特异性硫醇氧化还原酶，在内质网的糖蛋白折叠过程中促进分子内和分子间二硫键的形成以及折叠反应。研究证实，ERp57可以在细胞因子刺激或者应激状态下从细胞质转移至细胞核，通过与信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)相互作用而增强STAT3的转录活性。此外，ERp57在多种肿瘤中异常失调，影响下游基因DKC1、EGFR等的表达，从而影响细胞的增殖，参与多种肿瘤的进展及转移，并与不良预后相关，但ERp57在ccRCC中的表达及作用尚不清楚。
白细胞介素增强子结合因子3(Interleukin enhancer-binding factor 3, ILF3)，是一种双链RNA(dsRNA)结合蛋白。ILF3可与其他蛋白质、dsRNA、小非编码RNA或mRNA形成复合物，从而调节基因表达或稳定mRNA。研究表明ILF3具有促进肿瘤细胞增殖的作用，敲低ILF3能通过降低相应mRNA的稳定性进而使得细胞周期停滞及抑制细胞增殖。然而ILF3在ccRCC中的作用尚未充分阐明。
目的：本研究拟以人体肾透明细胞癌组织、人肾透明细胞癌细胞株和裸鼠肾透明细胞癌模型作为研究对象，应用免疫组织化学及多种分子生物学方法，观察ERp57、ILF3以及STAT3在ccRCC中的表达，探索三者在ccRCC发生发展中的作用及相互关系，以期为临床上寻找ccRCC治疗新靶点提供理论依据。
方法：
1.收集35例ccRCC患者肿瘤组织和癌旁组织，HE染色常规观察。免疫组织化学、Westernblot及qRT-PCR检测ERp57、ILF3在ccRCC癌组织与癌旁组织的表达水平。
2.通过癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库分析了ccRCC组织与癌旁组织中ERp57、ILF3的表达以及对ccRCC患者总体生存率的影响。
3.MTT法检测敲低或过表达ERp57对ccRCC细胞增殖能力的影响。
4.克隆形成实验检测在SW839细胞中敲低ERp57或过表达ILF3、A498细胞中过表达ERp57或敲低ILF3的ccRCC细胞增殖能力。同时检测在SW839细胞中联合敲低ERp57与过表达ILF3、联合敲低ERp57与STAT3，在A498细胞中联合过表达ERp57与敲低ILF3、联合过表达ERp57与敲低STAT3对ccRCC细胞增殖能力的影响。
5.Brdu染色检测ccRCC细胞中敲低ERp57、STAT3及ILF3，或联合敲低STAT3及ILF3、STAT3及ERp57时的细胞增殖情况。
6.Transwell迁移实验测定敲低或过表达ERp57对ccRCC细胞迁移能力的影响。
7.免疫双荧光染色检测ccRCC组织中ERp57与ILF3的细胞定位。
8.应用放线菌素D(ActD)阻止转录后，使用qRT-PCR分析来测量在SW839细胞中敲低ILF3或A498细胞中过表达ILF3对ERp57mRNA水平随时间变化的影响。
9.ccRCC细胞中敲低或过表达ILF3并给与STAT3抑制剂氯硝柳胺处理，Westernblot检测STAT3、p-STAT3和CyclinE1的表达情况。
10.Westernblot和实时定量PCR(qRT-PCR)测量ERp57、ILF3、STAT3、CyclinE1、CyclinD1蛋白质以及mRNA在ccRCC组织以及细胞中的表达。
11.免疫共沉淀(CoIP)检测ERp57与STAT3之间的蛋白质-蛋白质相互作用。
12.染色质免疫共沉淀(ChIP )和启动子荧光素酶报告基因证明STAT3-ERp57复合物与ILF3启动子的结合及对ILF3的转录水平调控作用。
13.RNA免疫共沉淀(RIP)和RNA生物素下拉实验检测ILF3与ERp57mRNA的相互作用。
14.构建稳定敲低ERp57、ILF3以及联合敲低ERp57和ILF3的ccRCC细胞株，并构建裸鼠移殖瘤模型，Westernblot检测异种移殖肿瘤p-STAT3、ERp57、ILF3、CyclinE1以及Cleavedcaspase-3的表达。BrdU染色检测异种移植肿瘤细胞增殖能力。
结果：
1.ERp57在ccRCC组织中的表达
1.1ERp57在ccRCC组织中的表达及与预后的关系
qRT-PCR、Westernblot及免疫组织化学结果表明，与癌旁组织相比，ccRCC组织中ERp57的mRNA和蛋白质水平均异常升高。分析ERp57的mRNA表达水平与患者临床病理特征的关系发现，ERp57的mRNA表达水平与肿瘤大小呈正相关。进而，应用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库分析了ccRCC肿瘤组织ERp57的表达水平及与患者总体生存率的关系，结果显示，ccRCC肿瘤组织中的ERp57mRNA水平比癌旁肾脏组织明显增高，且ERp57表达高的ccRCC患者总体预后不良。
1.2ERp57与ccRCC细胞的增殖和转移的相关性
qRT-PCR结果显示，6种不同的ccRCC细胞系中，ERp57在A498细胞中表达最低，在SW839细胞中表达最高。MTT及克隆形成实验结果显示，与空载体相比，A498细胞ERp57的过表达促进细胞的增殖，而敲低ERp57则抑制SW839细胞的增殖。此外，Transwell迁移实验表明，ERp57的过表达诱导A498细胞迁移，敲低SW839细胞中的ERp57导致细胞迁移能力显著降低。
2.ERp57与ILF3在ccRCC组织中的调控关系
选择之前报道的受ERp57调控且与细胞增殖相关的基因ILF3。免疫双荧光结果同时表明，在ccRCC组织中，ERp57定位于细胞浆中，ILF3定位于细胞核中，二者在ccRCC组织中同时增高。
qRT-PCR及Westernblot结果显示，过表达ERp57促进ccRCC细胞中ILF3的表达，而敲低ERp57抑制ccRCC细胞中ILF3表达。另外，qRT-PCR、Westernblot和IHC结果显示与癌旁肾脏组织相比，ccRCC组织中的ILF3mRNA及蛋白表达水平明显更高。同时通过TCGA数据库分析结果也证实ILF3在ccRCC组织中表达更高，且高表达ILF3的ccRCC患者总体预后不良。进一步分析ILF3表达与ccRCC患者的临床特征，结果显示ILF3mRNA水平的升高与肿瘤瘤体增大显著相关。相关性分析发现在ccRCC组织中，ERp57与ILF3呈正相关。
3.ERp57/STAT3/ILF3在ccRCC细胞中的相互作用
3.1STAT3介导ERp57对ILF3的调控
Westernblot及qRT-PCR结果表明，与单独敲低ERp57或STAT3相比，在SW839细胞联合敲低STAT3及ERp57的表达均可显著降低ccRCC细胞的ILF3蛋白及mRNA表达水平，在A498细胞中同时敲低STAT3而过表达ERp57仍然导致ILF3蛋白及mRNA水平的降低，但在一定程度上逆转了降低的程度，说明STAT3介导ERp57对ILF3的调控。BrdU免疫组织化学显示，仅敲低STAT3或ERp57即可抑制细胞增殖，联合敲低STAT3和ERp57则进一步增强这种抑制作用。
3.2ERp57/STAT3复合物转录水平调控ILF3表达
免疫共沉淀(CoIP)进一步证实了STAT3和ERp57之间存在蛋白质-蛋白质相互作用。ChIP-qPCR分析结果显示STAT3和ERp57蛋白可以与ILF3启动子区相结合。荧光素酶报告基因分析法发现ERp57的过表达明显增加了ILF3启动子中存在的荧光素酶载体的活性。但是，内源性STAT3敲低并转染ERp57过表达载体后，荧光素酶活性保持不变。这表明STAT3与ILF3启动子直接交联，调节ILF3转录。
3.3ILF3在ccRCC中调节ccRCC细胞ERp57的表达
qRT-PCR结果发现ILF3的过表达升高了ccRCC细胞中ERp57mRNA的水平，而敲低ILF3则降低了ccRCC细胞中ERp57mRNA的水平。应用放线菌素D(ActD)阻止转录后，使用qRT-PCR分析来测量ERp57mRNA水平随时间的变化。发现，ILF3敲低抑制了ActD对ERp57mRNA稳定性的作用，ILF3的过表达促进了ActD对ERp57mRNA稳定性的作用。CoIP结果表明，ILF3抗体可以下拉足够水平的内源性ILF3蛋白。继而通过RIP分析表明，在被ILF3抗体下拉的蛋白质-RNA复合物中存在CyclinE1和ERp57mRNA3UTR。同样地，Biotin-oligopulldown也显示，ERp57mRNA-3UTR和阳性对照CyclinE1mRNA探针的沉淀物中含有ILF3蛋白。这些结果表明ILF3可以结合ERp57mRNA3UTR并增强其mRNA稳定性。
克隆形成实验结果表明，ILF3的过表达促进了ccRCC细胞的增殖，而ILF3的敲低耗尽则导致ccRCC细胞增殖减少。此外，ILF3的过表达与ERp57的敲低相结合，逆转了ILF3过表达诱导的细胞增殖的增加以及ERp57敲低导致的细胞增殖的减少。并且，ERp57的过表达与ILF3的敲低相结合，减弱了由于ILF3敲低引起的细胞增殖减少以及ERp57过表达引起的细胞增殖增加。这些发现支持ILF3通过促进ERp57mRNA稳定性来参与ccRCC细胞增殖的调节。
3.4ILF3/ERp57/STAT3反馈回路在ccRCC细胞增殖中的作用
Westernblot结果显示应用STAT3抑制剂氯硝柳胺处理SW839和A498细胞，发现磷酸化的STAT3(p-STAT3)、CyclinE1和ILF3的水平降低，但对总STAT3蛋白水平没有影响。而这种对p-STAT3的抑制作用可以通过同时敲低SW839细胞中的ILF3来增强，而通过在A498细胞中过表达ILF3来逆转。BrdU染色以及克隆形成试验结果表明，抑制STAT3或ILF3可以减少SW839细胞的增殖，而同时抑制STAT3及ILF3导致SW839细胞增殖进一步减少。SW839细胞中同时转染shSTAT3和shERp57可增强ccRCC细胞生长的抑制作用，而ERp57的过表达则可以逆转STAT3敲低导致的A498细胞生长抑制。
4.体内实验中，ILF3/ERp57/STAT3通路在ccRCC细胞增殖中的作用
将具有稳定敲低的ERp57或ILF3或ERp57与ILF3联合敲低的SW839细胞植入裸鼠。与载体对照组相比，shERp57和shILF3组的肿瘤体积明显缩小。此外，与植入单独敲低ERp57或ILF3的小鼠相比，植入联合敲低ERp57和ILF3的SW839细胞的小鼠肿瘤体积及平均湿重明显更低。Westernblot分析表明，单独敲低ERp57或ILF3会显著下调p-STAT3，ERp57，ILF3和CyclinE1的水平，并且与载体对照组相比，裂解的caspase-3表达增加。通过联合敲低ERp57和ILF3可以增强这些作用。BrdU染色表明，敲低ERp57或ILF3抑制肿瘤细胞的增殖，联合敲低ERp57和ILF3抑制增殖作用进一步增强。
结论：
1.ERp57及ILF3在肾透明细胞癌细胞均呈过表达，且ERp57、ILF3的高水平表达与患者的不良预后有关。
2.ILF3与ERp57结合并通过增强其mRNA稳定性正向调节ERp57的表达。
3.ERp57的异常表达通过启动与ccRCC患者预后相关的STAT3/ILF3反馈环促进ccRCC细胞的增殖进展。这些结果为ERp57/STAT3/ILF3反馈回路参与ccRCC肿瘤细胞代谢的调控提供了有力的证据，有可能成为ccRCC的潜在治疗靶点。