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目的:本实验通过用小分子物质ST3205转染成纤维细胞,用嘌呤霉素筛选GFP+细胞,再用神经细胞培养液体外诱导分化,显微镜下密切观察并记录细胞形态的变化,用免疫荧光、激光共聚焦检测细胞中MAP-2、β-tubulin、MBP、GFAP等神经细胞标志物的表达,并将诱导的细胞注射入小鼠的脑内,追踪诱导细胞并观察移植细胞迁移、分化和存活等情况,探讨成纤维细胞重编程为神经细胞的基础研究。方法:1成纤维细胞的培养:从毓璜顶医院取成人、儿童包皮,分离人包皮成纤维细胞,取2-5代对数生长期细胞转染;人成纤维细胞系(HFF)、小鼠成纤维细胞系L929购自中科院上海细胞库,对细胞系进行培养扩增,作为细胞来源。2 ST3205慢病毒转染成纤维细胞:取成纤维细胞种在12孔板中(4万个细胞/孔),当细胞融合率达到50%时,换液(200μl成纤维细胞培养基+诱导液300μl神经细胞培养液),加病毒液和Polybrene转染剂,24h后加Vc、VPA,48h后追加培养液,72h后把含病毒的培养液吸弃,换上神经细胞诱导液继续培养。实验开始时,先摸索出慢病毒转染的最适条件,再进行实验。3诱导分化为神经细胞:病毒转染后,用嘌呤霉素筛选出GFP+的细胞,每两天换液,每天显微镜下观察并记录细胞形态的变化,观察细胞绿色荧光的表达情况,当细胞长满时给予传代,传到预先铺有玻片的24孔板中。4检测神经细胞:分别用神经元培养液和神经胶质细胞培养液培养诱导的细胞,诱导它们分化为神经元和胶质细胞。诱导分化成神经元时,培养2d后加入RA,10d后加入BDNF,每天换液;分化成胶质细胞时,隔天换液。5动物实验:将诱导的细胞注射入小鼠脑内,饲养2w后,追踪细胞。结果:1成功培养扩增大量人包皮成纤维细胞、人成纤维细胞、L929细胞。2慢病毒转染后,用嘌呤霉素筛选转染上携带绿色荧光ST3205的细胞(即都表达GFP的细胞),获得全都表达GFP的细胞。3转染后密切观察细胞形态变化,给诱导后7d、14d、21d、28d、35d、38d、40d、42d的细胞拍照,观察到细胞形态发生明显改变。4神经元培养液培养转染细胞,形成表达MAP-2、NeuN、β-tubulin的类神经元细胞;神经胶质细胞培养液培养转染细胞,形成表达MBP、GFAP的类神经胶质细胞。5取脑做石蜡切片,观察到有绿色荧光表达的细胞。结论:本研究成功的进行了人包皮成纤维细胞(Human postnatal foreskin fibroblast,hPFF)的原代培养,扩增了大量HFF及L929细胞;成功进行了转染,用表达携带绿色荧光的ST3205感染成纤维细胞,获得了 ST3205过表达阳性成纤维细胞;再用神经细胞诱导液诱导分化成纤维细胞,形成类神经细胞。