骨骼是一种不断更新的动态器官。破骨细胞(osteoclast, OC)和成骨细胞(osteoblast,OB)是分别负责骨吸收和骨重建的功能细胞,骨更新动态平衡的破坏会引起一系列的骨代谢异常性疾病,如骨质疏松、骨硬化症等。维生素D是一种类固醇类激素,1a,25-(OH)2D3是维生素D在体内的最强活化形式,参与骨代谢的调节,在维持机体内钙离子稳态中有着重要作用。TRPV5是一种发现于肾小管的,对Ca2+具有高敏感性的通道蛋白。研究发现,缺少TRPV5通道,将影响OC的分化及骨吸收功能,但对于其作用机制目前还不清楚。本文研究了TRPV5在小鼠单核细胞分化为OC过程中的作用和机制,以及在维生素D调控OC分化过程中的作用。为进一步阐明OC相关的骨吸收活动调节机制提供理论依据,研究内容如下：1.细胞接种密度对维生素D调控OC分化的影响为了研究单核细胞不同接种密度对OC分化能力的影响,从4至5周龄BALB/c小鼠骨髓腔分离得到骨髓单核细胞,以0.3、0.7、1.5、3、6、12、24、48×104/孔(0.94、2.18、4.68、9.37、18.75、37.5、75、150×104/cm2)的密度接种于96孔板。用含50 nmol/L M-CSF和30 nmol/L RANKL 的α-MEM培养液培养3 d,更换培养液为含30nmol/L M-CSF、50 nmol/L RANKL 及 10 nmol/L 1,25(OH)2D3 的 α-MEM,培养2 d后TRAP染色鉴定OC,免疫荧光检测OC中VDR表达水平。结果显示,随着单核细胞接种密度的升高,OC生成数量增加,呈上升趋势；但OC的生成率与细胞接种密度呈负相关,接种浓度越高,则OC的生成率越低,呈下降趋势。VDR在单核细胞、未成熟的OC以及成熟OC中均有分布。不同接种密度的单核细胞,维生素D对其分化为OC的影响不同。当细胞接种密度为18.75、37.75、75×104/cm2时,与空白组相比维生素D可以显著抑制OC的生成；而接种浓度为0.93、2.18×104/cm2时,维生素D可以显著促进OC的生成。2.TRPV5在OC分化及骨吸收中的作用为了探讨TRPV5在OC分化及骨吸收过程中的作用,本实验采用RuR作为TRPV5通道阻滞剂,研究不同浓度RuR (0、10、50、100、500、1000nmol/L)对OC分化以及活性的影响。同时,RuR在不同浓度和时间下(1、2、3 d)作用OC, western-blot检测OC中TRPV5以及骨吸收活性相关蛋白V-ATPase、CTSK、TRAP、Call表达水平。结果表明,0、10、50、100、500以及1000nmol/L RuR对OC活性没有显著影响,但是各浓度的RuR均显著抑制OC的分化能力。不同浓度(10、100、1000nmol/L) RuR在不同时间(1、2、3d)均显著抑制TRPV5的表达,同时骨吸收活性相关蛋白V-ATPase、 CTSK、TRAP以及CaⅡ的表达量也出现一定程度下降,并且NFATc1的表达水平呈现一定程度的抑制。3.TRPV5在维生素D调控OC中的作用为了研究TRPV5在维生素D调控OC分化及骨吸收过程中的作用,在不同浓度、时间下通过维生素D作用OC,检测维生素D对TRPV5表达水平的影响。在第3、5、7 d添加维生素D、维生素D+TRPV5阻滞剂(RuR/ECO)、TRPV5阻滞剂(RuR/ECO加处理,每次处理时间为2 d,于第9 dTRAP染色并计数OC。同时,利用western-blot检测骨吸收标志蛋白V-ATPase、CTSK、TRAP、Call以及OC转录因子NFATc1在该条件下的表达水平。结果显示,维生素D仅在处理1 d和2 d时抑制TRPV5的表达水平。也仅在2 d时维生素D显著抑制OC分化,同时,添加维生素D+TRPV5阻滞剂可持续抑制OC的分化,但维生素D组与维生素D+TRPV5阻滞剂组OC分化水平并没有显著差异性。维生素D+TRPV5阻滞剂组与维生素D组相比显著抑制了骨吸收标志蛋白V-ATPase、CTSK、TRAP、Call的表达,但是对NFATc1的表达水平并没有显著影响。结果表明,维生素D通过降低TRPV5在OC前体细胞中的表达,从而抑制RANKL通过TRPV5激发NFATc1,抑制前体细胞向OC的分化。