论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的病理特征是中脑黑质致密部(substantia nigra pars compact,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元的选择性缺失,以及由此而导致的纹状体轴突末梢DA的耗竭。有证据表明,L型Ca2+通道(L-type calcium channels,LTCCs)参与PD发病过程中DA能神经元的选择性退变死亡过程,使用LTCCs阻断剂能延缓PD的发病;然而,LTCCs参与PD发病的具体机制仍不明确。中脑DA能神经元存在自主起搏现象,其自主起搏依赖L型Cav1.3型Ca2+通道。在自主起搏时Ca2+通道的持续开放导致胞浆Ca2+超载,这是黑质DA能神经元选择性变性死亡的重要原因之一。本实验室前期研究,以及PD病人尸检和PD动物模型中都发现了黑质(substantia nigra,SN)铁的沉积,铁能加剧DA能神经元内的氧化应激,从而造成DA能神经元的损伤。但铁选择性沉积于SN的原因目前并不明确。有文献报道,高铁环境下,L型Cav1.2型Ca2+通道可介导铁进入心肌细胞;铁也可以经由LTCCs进入培养的神经细胞。为研究LTCCs如何参与PD的发病过程,以及LTCCs是否能介导PD模型小鼠SN区铁的选择性聚积,本实验以MPTP制备的C57/BL6 PD模型小鼠及MPP+损伤的DA能MES23.5细胞系和腹侧中脑原代神经元为观察对象,采用分子生物学、行为学、免疫组织化学等综合研究方法来探讨LTCCs在黑质多巴胺能神经元损伤及其铁聚积中的作用,实验结果如下:1.MPTP处理小鼠第2周开始,小鼠在旋转棒上停留的时间明显少于对照组,差别具有统计学意义(P<0.05);与MPTP处理组相比,伊拉地平与MPTP共处理组的小鼠在第3、4周时,停留在旋转棒上的时间明显增加,结果具有统计学意义(P<0.05)。2.与对照组相比,MPTP处理组小鼠SN区L型Cav1.2和Cav1.3型Ca2+通道α1亚单位m RNA表达量在第2、3周均明显上调(P<0.01),伊拉地平与MPTP共处理组小鼠SN区通道m RNA的表达量与MPTP处理组相比显著降低,差别有统计学意义(P<0.01)。3.与对照组相比,MPTP处理组小鼠SN区L型Cav1.2和Cav1.3型Ca2+通道α1亚单位蛋白表达量在第2、3周均明显上调(P<0.01)。Cav1.2型Ca2+通道α1亚单位蛋白的表达水平在第2周时达到高峰,而Cav1.3型Ca2+通道α1亚单位蛋白的表达水平在第3周时达到最高水平(P<0.05,与对照组相比)。伊拉地平与MPTP共处理组的小鼠,通道蛋白的表达水平与MPTP处理组相比显著下降(P<0.05)。4.与对照组相比,MPTP处理组小鼠黑质区DA能神经元数目在第2、3和4周均显著减少,结果有统计学意义(P<0.01)。伊拉地平与MPTP共处理组的小鼠SN区,DA能神经元的数目与MPTP处理组相比显著增多(P<0.05)。5.MPTP诱导的PD模型小鼠从第2周开始出现纹状体DA及其代谢产物DOPAC和HVA含量的显著降低(P<0.05,与对照组相比),伊拉地平与MPTP共处理组小鼠纹状体DA含量与MPTP处理组相比明显提高,且在第2周时作用最明显(P<0.05)。虽然伊拉地平在一定程度上提高了DOPAC和HVA的含量,但与MPTP处理组相比无统计学差异(P>0.05)。6.从MPTP处理的第2周开始,小鼠SN区出现铁染色阳性细胞数目的持续增加,与对照组相比,差别具有统计学意义(P<0.05);而伊拉地平与MPTP共处理组小鼠SN区铁染色阳性细胞数目较MPTP处理组明显降低(P<0.05)。7.200μmol/L和100μmol/L MPP+分别处理体外培养的MES23.5细胞系和腹侧中脑原代神经元24 h后,应用荧光染料calcein作为指示剂,使用1 mmol/L Fe SO4灌流,与对照组相比,MES23.5细胞系和腹侧中脑原代神经元中铁含量明显增加(P<0.05);当灌流液中加入0.02 mmol/L伊拉地平后,与MPP+损伤组相比,MES23.5细胞系和腹侧中脑原代神经元中铁含量明显降低(P<0.05);在灌流液中加入0.01mmol/L的Bayk8644后,与MPP+处理组相比,神经元内铁含量明显增加(P<0.05)。通过以上实验,我们得到如下结论:应用伊拉地平阻断LTCCs不但能改善PD模型小鼠的运动协调能力、保护SN区的DA能神经元以及降低黑质区的铁阳性细胞数;还能在一定程度上抑制PD发病过程中LTCCs表达的增高。使用LTCCs阻断剂以及激动剂特异性阻断或激活LTCCs,可改变神经元铁的转运过程。以上结果提示:PD发病过程中LTCCs表达量增加,以及其参与的SN区铁选择性聚积可能是导致DA能神经元损伤的重要原因。本研究为探索PD发病过程中LTCCs的作用及SN区铁聚积的机制提供了新的实验依据。