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纤维素是植物生物质的重要组成部分,在当今资源和能源日益枯竭的情况下,大力开发、转化、利用木质纤维素,将其转化成可发酵糖、饲料或是生物燃料,以应用于人类急需的能源、食物、化工原料,这对解决人类社会的食物短缺和能源危机具有重大现实意义。纤维素酶中β-葡聚糖酶对各个领域都有积极的作用,比如食品、纺织、洗涤、酿酒、医药等行业,都有广泛的应用价值。目前国外对来源于嗜热梭菌所产p-葡聚糖酶的研究技术比较成熟,而我国对β-葡聚糖酶的研究还处于起步阶段,酶产量和比活低,耐热性较差,不适合工业化生产的要求。本研究首次将嗜热梭菌(Symbiobacterium thermophilum IAM14863)中的β-1,4-葡聚糖内切酶基因重组到表达载体pET32a(+)中,并在E.coli BL21(DE3)PLYS中进行表达,成功构建了耐热且酶活高的基因工程菌,并研究了诱导表达重组酶的影响因素,并对纯化后的酶进行了酶学性质上的初步研究。结果如下：目的基因与其他细菌所产的葡聚糖内切酶同源性很高。首先将β-1,4-葡聚糖内切酶基因celGlu成功连接到pMD(?)18-T Simple Vector上,测序结果表明,该基因读码框碱基长度为1101bp,编码366个氨基酸。经Blast比较分析,该酶基因与Bacillus amyloliquefaciens、 Bacillus clausii、S.rochei、S.lividans、S.coelicolor、S.ambofaciens、Oceanobacillus iheyensis、 Listeria monocytoqenes报道的葡聚糖内切酶基因的同源性都高于95%。目的基因成功构建到了表达质粒pET32a中。重组表达质粒pET32a-celGlu的鉴定试验采用了三种方法,即抗性检测、PCR鉴定、酶切鉴定,结果重组质粒pET32a-celGlu能在Amp抗性条件下生长,能扩增出与目的基因大小一致的条带,且酶切后能得到与目的基因和质粒大小都分别一致的条带。目的基因转化至表达菌体BLP中,并实现了高效表达。将重组表达质粒pET32a-Glu成功转化到表达菌BLP后,经IPTG诱导培养,目的蛋白表达成功,电泳检测产生一条相对分子质量约为60kDa的特异性蛋白条带,但相对分子量比计算的理论值约大20kDa,此值与表达载体pET32a中Trx和His等融合标签大小一致。随着诱导时间的延长,目的蛋白的表达量呈增加趋势,占总蛋白的60%～80%,实现了该酶的超表达。利用刚果红染色试验对酶活进行了定性检测,菌落周围具有清晰的透明水解圈,说明该工程菌产纤维素酶且具有酶活。不同因素对重组菌发酵条件的影响不同。结果表明诱导温度对酶活的影响很大,随着温度的上升,酶活也随之增大,当温度在30℃时,酶活最高,诱导时间越长表达产物越多,考虑杂蛋白影响产物和诱导效率等原因,选择4h为最佳诱导时间。IPTG的浓度对表达产物的酶活并无太大的影响,选择了1mmol/L。接种量对产物的酶活有促进作用。诱导后的培养基中的酶活性可达268U/mL,是优化前的1.15倍。经超声破碎试验证明该重组酶主要为胞内酶,属于细胞间质表达。纯化过程采取离心,超声破碎,热变性,盐析,透析和浓缩等处理,然后经HisTrap HP亲和层析纯化后活力高达103U/mL。重组酶学性质实验表明,重组酶的最适反应温度为55℃,在50-65℃范围内酶活较高。耐热性实验表明该酶在低于75℃温度下保温时酶的活性比较稳定,保温1h后相对残余酶活仍在50%以上,70℃保温1h后残余酶活为75%且比65℃略有提高,说明高温对该酶有热激活作用,表明该重组酶具有稳定的蛋白质高级结构和良好的热稳定性。该酶的最适反应pH为5.0,为中性纤维素酶,适合在动物肠道内消化分泌,相同pH下不同种类的缓冲液对该酶的活性及稳定性影响不大。