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猪流行腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)的病原体。PEDV的感染主要引起猪严重的腹泻、呕吐和脱水,造成极高的死亡率,6日龄以内的仔猪感染PEDV后的死亡率高达100%,该病给世界养猪业造成了极大的经济损失,严重阻碍了养猪业的健康发展。目前,还没有有效的针对PEDV的特异性疫苗,因此,研究PEDV的致病机制对于疫苗的开发尤为重要。为了全面了解PEDV的致病机制,本研究通过转录组测序技术分析了PEDV感染Vero细胞后不同时间点基因表达情况,从而为发现新的PEDV发病机制的关键蛋白提供依据。首先,通过Illumina转录组测序技术对未感染PEDV的Vero细胞以及感染PEDV(MOI=0.5)12 h、24 h的Vero细胞进行了测序,对原始测序数据进行质控得到质控数据(Clean reads)。对Clean reads数据分析显示,与未感染的空白对照组相比,感染12 h组有4个显著性差异表达基因(|log2FC|≥1且p-adjust<0.05),感染24 h组有1085个显著性差异表达基因(|log2FC|≥1且p-adjust<0.05);与感染12 h组相比,感染24 h组有1643个显著性差异表达基因(|log2FC|≥1且p-adjust<0.05)。对上述筛选到的差异表达基因进行基因本体(Gene ontology,GO)功能注释分析,差异表达基因的GO注释集中在生物学过程、细胞组成以及分子功能三个方面并涉及到了细胞过程、生物调控、代谢过程、细胞组成、细胞器组成以及催化活性等。进一步对差异表达基因进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析,结果表明PEDV感染Vero细胞12 h,4个差异表达基因在非洲绿猴基因组中的靶基因注释仅富集在NOD-like receptor信号通路以及Micro RNAs in cancer信号通路;当PEDV感染Vero细胞24 h,部分细胞出现严重的病变效应,但细胞没有破碎脱落时,Vero细胞差异表达基因在非洲绿猴基因组中的靶基因注释主要富集在TNF信号通路、p53信号通路、Jak-STAT信号通路、免疫炎症以及肿瘤的转录调控等方面。p53是一种序列特异的DNA结合蛋白,作为一种转录因子可调控细胞的凋亡。Puma可促进细胞凋亡,是p53依赖和非依赖凋亡途径的一个关键介导者。目前,还没有PEDV感染后通过激活Puma并以p53依赖途径诱导细胞凋亡的报道。本研究在上述分析的基础上,分析与p53相关的差异表达基因,发现Puma基因参与p53信号通路的调控;进一步进行KEGG分析发现,Puma基因能够靶向p53信号通路上的BAX和Bcl-2基因。分别以MOI为0.1、0.5和1接种PEDV后使用流式细胞仪检测Vero细胞的凋亡率,以不接种PEDV的Vero细胞作为阴性对照。结果显示,与未感染PEDV组相比,不同感染复数的实验组均表现出了不同程度的细胞凋亡,且PEDV以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡。利用q RT-PCR检测p53信号通路上p53、Puma、BAX以及Bcl-2基因,结果与转录组测序结果一致。随后利用Western blotting进一步检测这四个基因在蛋白水平上的表达情况,结果显示,PEDV的感染上调了p53、Puma和BAX蛋白的表达(P<0.05),同时下调了Bcl-2蛋白的表达(P<0.05),由此推测PEDV的感染能够通过激活p53信号通路调控细胞凋亡。最后,通过在PEDV感染的Vero细胞中添加p53抑制剂Pifithrin-α后进一步证实,p53被抑制后,通过抑制Puma进一步抑制BAX蛋白的表达最终抑制细胞凋亡的发生。综上所述,PEDV感染Vero细胞后,可激活Puma并以p53依赖途径诱导细胞凋亡。通过激活p53蛋白及Puma蛋白的表达,进一步通过调控蛋白BAX以及Bcl-2的表达介导细胞凋亡。研究结果为进一步阐明PEDV的致病机制及开发针对PEDV的有效疫苗奠定了基础。