【摘 要】
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背景和目的:肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率的不断升高给人类的生命健康造成了严重的危害。NME2表达与肝癌发生密切相关。但是其在肝癌发生发展中的相互作用蛋白及信号网络尚不明确,因此,本研究利用捕集离子淌度飞行时间质谱分析肝癌细胞中NME2相关蛋白及信号网络,为肝癌分子病理研究提供实验依据。研究方法:（1）生物信息学分析肝癌中NME2的表达水平及验证NME2对肝癌细胞增殖及集落形成的影
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背景和目的:肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率的不断升高给人类的生命健康造成了严重的危害。NME2表达与肝癌发生密切相关。但是其在肝癌发生发展中的相互作用蛋白及信号网络尚不明确,因此,本研究利用捕集离子淌度飞行时间质谱分析肝癌细胞中NME2相关蛋白及信号网络,为肝癌分子病理研究提供实验依据。研究方法:（1）生物信息学分析肝癌中NME2的表达水平及验证NME2对肝癌细胞增殖及集落形成的影响:首先通过UALCAN软件和Oncomine数据库分析NME2在肝癌组织和正常肝组织中的表达情况;选取肝癌细胞Hep G2细胞通过慢病毒载体体外构建敲低NME2的稳定肝癌细胞系,实验分为sh-NME2组和sh-NC组。在两组细胞感染72h并培养4代后,使用蛋白免疫印迹法检测两组细胞NME2蛋白的表达水平;MTT法检测NME2对Hep G2细胞增殖能力的影响;平板集落形成实验和软琼脂集落形成实验检测NME2对肝癌细胞集落形成能力的影响。（2）质谱技术及生物信息学分析NME2相关蛋白及信号网络:本研究分别提取了Hep G2两个分组的总蛋白质,通过蛋白质定量、胰蛋白酶解、TMT标记和HPLC分类后,利用UPLC分离肽段,并且采用Tims-TOF MS进行分析,以检测到的蛋白质丰度差异为依据,搜索相关的数据库,最后得出差异表达的蛋白质分子,并结合生物信息学分析方法,分析差异表达蛋白主要参与的信号通路和蛋白之间的作用网络。结果:（1）UALCAN软件和Oncomine数据库分析结果显示NME2在肝癌组织中表达水平明显高于正常肝组织,差异具有统计学意义;Hep G2细胞稳定敲低NME2后,蛋白免疫印迹检测结果表示,在sh-NME2组中NME2蛋白水平明显低于sh-NC组,说明稳定低表达NME2的Hep G2细胞系构建成功;MTT法检测结果表明,在sh-NME2组中细胞活力明显低于sh-NC组;平板集落形成实验和软琼脂集落形成实验结果显示,与sh-NC组相比,sh-NME2组细胞的集落形成能力显著降低。（2）TMT标记和质谱分析结果显示,共鉴定出6656个蛋白质,其中以sh-NME2/sh-NC的比值相差1.3倍为差异表达变化的阈值,并且t检验P<0.05为显著性阈值,与sh-NC相比,sh-NME2组中共有253个蛋白质表达上调,163个蛋白质出现下调;KEGG富集分析筛选出差异蛋白显著富集50条信号通路,上调蛋白主要参与NOD样受体信号通路、类固醇激素的生物合成、p53信号通路和JAK-STAT信号通路等,下调蛋白主要参与PPAR信号通路、胆固醇陈代谢、系统性红斑狼疮和酒精依赖性信号通路等;STRING软件分析结果表明NME2与p53、JAK-STAT、PPAR和酒精依赖性信号通路中的25个蛋白关系密切。结论:（1）NME2蛋白在肝癌组织中高度表达,肝癌细胞Hep G2敲低NME2后细胞增殖和集落形成能力均受到抑制,实验结果均与课题组之前研究结果一致。NME2有望成为肝癌治疗研究新的靶标。（2）NME2可能通过p53、JAK-STAT、PPAR和酒精依赖性信号通路以及与4条信号通路中的25个蛋白相互作用促进肝癌的发生发展。
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