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背景及目的:自噬是细胞自我吞噬、降解并消化细胞内物质组成的重要过程,对于维持细胞内稳态具有重要作用。miR-34a是调控自噬的重要miRNA。大量的研究证据表明,在多种与神经系统相关的疾病,尤其是阿兹海默病和衰老中,都存在着miR-34a的上调和自噬系统的缺陷。阿尔兹海默病与放射性认知损害都与神经退行性变相关。那么放射性认知损害会不会也引起上述miRNA的变化及自噬水平的降低?本课题尝试采用20Gy单次全脑照射引起的认知功能损害模型,通过基因芯片来筛选照射后变化较显著的miRNA,并结合数据库(Targetscan,microRNAorg,pita)对差异miRNA进行靶基因(如自噬相关蛋白)预测,初步探索miRNA及其自噬相关的靶基因在放射性认知障碍中的作用。同时结合本课题组前期体外研究在HT-22细胞中确证了米诺环素的保护机制:海马神经元经X射线照射后其AMPKα1被激活,从而激活了自噬通路,这种自噬是保护性的自噬,米诺环素通过促进HT-22细胞内AMPKα1介导的自噬,进而抑制射线诱导的细胞凋亡。于是本课题猜想米诺环素会不会在体内也增加这种保护性自噬而抑制海马神经元的凋亡,因此本课题接着用WesternBlot实验来验证米诺环素处理后大鼠照射后海马区自噬水平的变化。实验方法:(1)SD大鼠照射后海马区自噬体的观察:大鼠照射后1月,快速取出对照组和照射组大鼠海马,将组织切成1mm3左右小块,固定于2.5%戊二醛固定、脱水、干燥后电镜下观察自噬体。(2)SD大鼠全脑照射后miRNA及靶基因(自噬相关蛋白)的变化情况:全脑照射照射后1个月分别处死对照组、照射组大鼠,每组5只,取其海马组织进行基因芯片筛选显著上调或者下调的miRNA,并用PCR来验证另两批照射组、对照组miRNA的表达变化,用Targetscan来预测miRNA的靶基因,并用WesternBlot验证miRNA的靶基因(自噬相关蛋白)水平变化。(3)米诺环素对全脑照射引起的自噬水平的调控作用:该部分大鼠分为对照组(CN)、米诺环素组(CM)、照射组(RN)、照射联合米诺环素组(RM),每组9只,共36只。给药组于照前1天灌胃米诺环素90mg/kg·d,照后维持45mg/kg·d。经3.6%水合氯醛麻醉后,照射组与照射联药组大鼠行单次20Gy全脑照射。于全脑照射4h、8h及1m后取其海马组织,用WesternBlot验证LC3II及P62的蛋白水平。实验结果:(1)电镜下观察到大鼠海马区照射后4h存在自噬体。(2)我们发现了miRNA-34a在照射后1m大鼠中显著上调,且PCR实验也验证了miR-34a在照射后上调,且有统计学差异。通过数据库分析我们找到自噬相关蛋白Atg4B是miR-34a的靶基因。Westernblot实验验证了照射后1m组大鼠Atg4B水平降低。(3)大鼠在受20Gy电子线全脑照射后不同时间点(4h、8h和1m)其海马区LC3II水平虽未显示明显变化,但是米诺环素处理的大鼠其海马区的LC3II却在照后1m显著升高。并且,经自噬降解的P62在受照大鼠的海马区呈现上升,而米诺环素抑制了这种上升。提示照射可能导致了海马区的自噬下调,而米诺环素有促进自噬的作用。结论:1、大鼠在接受脑部照射后,其海马区miR-34a表达上升,Atg4B的蛋白表达下降,而Atg4B是miR-34a重要的自噬调控基因,本论文猜测miR-34a/Atg4B介导的自噬在认知障碍中具有一定作用。2、照射可能导致了海马区的自噬下调,而米诺环素有促进自噬的作用。