目的:恶性黑色素瘤是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,发病率逐渐上升,严重威胁人们的健康。已有研究表明,恶性黑色素瘤的发生、发展是一个由多种癌基因、抑癌基因共同参与的多阶段过程。癌基因PPO在多种肿瘤组织中存在过表达。c-Myc、c-Fos基因为核内癌基因,参与细胞增殖和凋亡的调控,在恶性黑色素瘤中存在过表达。PPO基因位于细胞质内,是MAPK通路中一个新的癌基因,而c-Myc、c-Fos基因也都是MAPK通路中的癌基因。鉴于恶性黑色素瘤的发生、发展与MAPK通路有密切关系,PPO在恶性黑色素瘤中的表达情况,与c-Myc、c-Fos的关系以及在MAPK通路中的位置都很值得研究。探讨恶性黑色素瘤的发病机制,对降低恶性黑色素瘤的发病率和死亡率,有着十分重要的意义。恶性黑色素瘤常规化疗不佳,基因靶向治疗成为了新的方向。RNA干扰是双链RNA分子在mRNA水平上关闭相关基因表达的过程,人们开始将其用在药物靶向治疗恶性黑色素瘤等研究上。RNA干扰癌基因PPO能否发挥体内外抑制恶性黑色素瘤细胞的作用,是否具有临床应用价值值得期待。中药辅助治疗也很有现实意义。三氧化二砷是砒霜的主要成分,可通过抑制NF-κB P65和C-IAP2基因的表达诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡。三氧化二砷诱导A375细胞凋亡是否还存在其它传导通路,在体内是否同样有效,是否通过下调PPO基因而发挥抑制作用值得进一步研究。为此,本研究涉及癌基因PPO在恶性黑色素瘤发生、发展中的作用,PPO在MAPK通路中的位置,PPO基因靶向治疗和中药治疗4个方面,从组织水平、细胞水平、分子水平3个层面,从发病到治疗进行一系列初步研究。拟探讨PPO、c-Myc及c-Fos蛋白在恶性黑色素瘤组织中的表达情况及其意义;应用RNAi技术沉默PPO,观察对人恶性黑色素瘤细胞A375的增殖抑制,观察其对荷瘤裸鼠体内黑色素瘤的生长抑制,并探讨其可能的作用机制;观察A_S2O₃对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响,检测干预前后PPO蛋白表达的变化,观察A_S2O₃对荷瘤裸鼠体内肿瘤生长的抑制,探讨下调PPO的表达是否是A_S2O₃治疗恶性黑色素瘤的作用机制之一。以期揭示癌基因PPO与恶性黑色素瘤发生和发展的分子机制,为PPO成为恶性黑色素瘤临床诊断参考指标和基因靶向治疗恶性黑色素瘤的新靶点等方面提供理论依据。方法:1 PPO、c-Myc及c-Fos蛋白在恶性黑色素瘤组织的表达及意义免疫组织化学方法及流式细胞术检测恶性黑色素瘤、色素痣组织中PPO、c-Myc及c-Fos蛋白的表达。2研究RNAi沉默PPO基因对人恶性黑色素瘤细胞株A375增殖和凋亡的影响PPO腺病毒载体和空转录病毒载体均为携带绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）,转入细胞后有绿色荧光表达。将它们转染入人恶性黑色素瘤A375细胞;荧光显微镜下观察不同MOI（病毒个数/细胞个数）=5,10,20,50,100时,腺病毒转染A375细胞的效率及细胞分化、形态变化。取转染48h后细胞做RT-PCR,观察A375细胞PPO的表达变化。MTT比色分析法检测MOI=50时,在转染后第1天、第3天、第5天、第7天对A375细胞增殖抑制的影响。采用流式细胞分析术,Anexin-V-PI双染色检测MOI=50时,在转染后第1天、第3天、第5天、第7天A375细胞早期凋亡的变化。3研究RNAi沉默PPO基因对荷瘤裸鼠黑色素瘤生长的抑制作用建立人恶性黑色素瘤A375裸鼠荷瘤模型,用PPO腺病毒载体作用于荷瘤裸鼠,观测瘤体大小和瘤体重量,计算抑制率,取出肿瘤进行HE染色。4研究A_S2O₃对人恶性黑色素瘤细胞株A375增殖和凋亡的影响,探讨其分子机制。常规培养人恶性黑色素瘤细胞株A375。采用MTT法检测不同浓度的A_S2O₃（1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）在24h、48h及72h三个时间点对人A375细胞的增殖抑制作用;流式细胞术分析A_S2O₃对细胞周期及凋亡的影响,倒置相差显微镜观察药物处理后对人A375细胞的细胞分化及形态的影响,免疫细胞化学s-p法和荧光免疫细胞化学方法检测A_S2O₃对PPO蛋白表达的影响。5研究A_S2O₃对荷瘤裸鼠黑色素瘤生长的抑制作用建立人恶性黑色素瘤A375裸鼠荷瘤模型,用A_S2O₃作用于荷瘤裸鼠,观测瘤体大小和瘤体重量,计算抑制率,取出肿瘤进行HE染色。结果:1 PPO、c-Myc及c-Fos在恶性黑色素瘤中的表达PPO蛋白阳性产物定位于细胞浆,呈棕黄色颗粒状,弥漫或散在分布;c-Myc及c-Fos蛋白阳性产物均定位于细胞核,呈棕黄色颗粒状,弥漫或散在分布。恶性黑色素瘤组织中PPO、c-Myc及c-Fos的表达与色素痣组织中PPO、c-Myc及c-Fos表达分别相比较,差异具有显著性（P <0.05）。2 RNAi沉默PPO基因对恶性黑色素瘤细胞株A375增殖和凋亡的影响转染24h后MOI=5,10,20,50,100时转染效率分别为55±3.5%、63.7±2.3%,72.3±2.5%、71.5±2.1%、75.6±1.6%。MOI=50时转染效率达到最大且增大MOI值转染效率不再变化,故以下转染实验取MOI=50时转染后不同时间对细胞的影响。A375出现不同程度的皱缩、破裂,细胞生长状态不佳,有的细胞变狭长两端出现伪足,漂浮细胞增多,随时间延长,上述现象更加明显。转染A375细胞48h后,用RT-PCR方法检测PPO基因mRNA表达,实验组较阴性对照组,空转录病毒组的mRNA表达强度减低,证明腺病毒已经成功转染A375细胞并部分沉默PPO基因。MTT比色分析法发现转染后第5天实验组与阴性对照组,实验组与空转录病毒组均有显著性差异（P<0.05）。流式细胞仪,Anexin-V-PI双染色检测MOI=50转染后不同时间A375细胞早期凋亡率的变化,与对照组相比,有显著性差异（P <0.05）。3 RNAi沉默PPO基因对荷瘤裸鼠黑色素瘤生长的抑制作用裸鼠皮下肿瘤细胞接种后,活动能力、饮食情况良好,在接种部位先后出现点状或点线状黑色素瘤体。每3天观察肿瘤生长情况,于第7天开始分组进行实验,根据每3天记录的肿瘤体积变化,绘制肿瘤生长曲线图,可以看出阴性对照组与空病毒转染组的肿瘤生长速度显著高于PPO转染组（P<0.05）,两对照组组间则没有差别（P>0.05）。第21天,处死裸鼠,剥离肿瘤,测量大小并称重。裸鼠的平均瘤重PPO转染组低于空转录病毒和阴性对照组,有显著性差异（P<0.05）,空转录病毒和阴性对照组比较无显著性差异（P>0.05）。PPO转染组抑瘤率为49.6%。将肿瘤瘤块进行HE染色研究,我们发现PPO转染组的肿瘤出现细胞坏死以及核固缩等凋亡现象,空转录病毒和阴性对照组无明显凋亡现象。4 A_S2O₃对人恶性黑色素瘤细胞株A375增殖和凋亡的影响及调控PPO蛋白的表达MTT法证实A_S2O₃在1μmol/L至10μmol/L浓度范围内对A375细胞有明显的增殖抑制作用,呈现明显的剂量和时间依赖效应关系。流式细胞术检测发现,随着药物浓度的增加,G0/G1的细胞逐渐减少（P<0.05）,S期的比例显著增加,出现S期阻滞。倒置显微镜观察发现细胞出现典型凋亡细胞形态学改变。免疫细胞化学法检测PPO蛋白主要表达于A375细胞胞浆内,染色呈棕黄色。A_S2O₃作用48h后,随着药物浓度的增加,PPO蛋白的染色程度逐渐减弱,差异具有显著性（P<0.05）。5 A_S2O₃对荷瘤裸鼠黑色素瘤生长的抑制作用裸鼠皮下肿瘤细胞接种后,活动能力、饮食情况良好,在接种部位先后出现点状或点线状黑色素瘤体。每3天观察肿瘤生长情况,于第7天开始分组进行实验,根据每3天记录的肿瘤体积变化绘制肿瘤生长曲线图,可以看出A_S2O₃组与顺铂组的肿瘤生长速度显著低于阴性对照组（P <0.05）,顺铂组较A_S2O₃组更低（P<0.05）。第21天,处死裸鼠,剥离肿瘤,测量大小并称重。A_S2O₃组裸鼠的平均瘤重低于阴性对照组,但高于顺铂组,均有显著性差异（P<0.05）。不同剂量A_S2O₃组的抑瘤率分别为52.6%、78.1%、86.2%。将肿瘤瘤块进行HE染色研究,我们发现A_S2O₃治疗组与顺铂组的肿瘤出现细胞坏死以及核固缩等凋亡现象,阴性对照组无明显凋亡现象。结论:1联合检测PPO、c-Myc及c-Fos蛋白在恶性黑色素瘤组织中的表达,证实了PPO、c-Myc及c-Fos在恶性黑色素瘤组织中的异常高表达,提示癌基因PPO、c-Myc、c-Fos在恶性黑色素瘤发生、发展中可能起重要作用。2 RNA干扰PPO经腺病毒载体成功转染人恶性黑色素瘤A375细胞。RNA干扰PPO能下调人A375恶性黑色素瘤细胞PPO基因的表达,对A375细胞有增殖抑制作用,并能诱导A375细胞早期凋亡。3 RNA干扰PPO在体内可以抑制恶性黑色素瘤荷瘤裸鼠的肿瘤生长。PPO有望成为恶性黑色素瘤治疗中重要的靶点。4 A_S2O₃可抑制人恶性黑色素瘤A375细胞的增殖,并诱导凋亡发生,且与A_S2O₃的浓度和作用时间成正相关。证实下调癌基因PPO的表达可能是A_S2O₃抑制A375细胞增殖的机制之一。5 A_S2O₃体内可以同样抑制肿瘤生长,但疗效不及顺铂,A_S2O₃可以作为恶性黑色素瘤辅助治疗药物,具有一定应用价值。