GILZ基因沉默增强脓毒症血清诱导成肌细胞合成代谢的实验研究

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目的:构建靶向大鼠GILZ的siRNA腺病毒载体,研究GILZ基因沉默对脓毒症血清诱导成肌细胞代谢的影响。  方法:  (1)应用盲肠结扎穿孔法建立大鼠脓毒症模型,留取脓毒症血清。  (2)设计靶向大鼠GILZ mRNA的特异性siRNA,退火形成双链DNA Oligo,插入AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的GV119载体,构建穿梭质粒,测序验证后与骨架质粒pBHG loxΔE1,3 Cre共转染HEK293细胞,收集重组腺病毒,扩增纯化后测定病毒滴度。  (3)重组腺病毒感染体外培养的L6细胞,观察绿色荧光蛋白表达情况及形态学改变,测定重组腺病毒的感染效率,实时荧光定量聚合酶链式反应检测GILZ的表达量。  (4)脓毒症血清诱导72h后,实时荧光定量聚合酶链式反应检测GILZ、MyHC、MyoD、myogenin的表达量。  结果:  (1)应用盲肠结扎穿孔法可成功建立脓毒症大鼠模型,大鼠的一般情况、体重、肛温、炎症指标、细菌培养及开腹探查结果符合脓毒症诊断标准。  (2)成功构建重组腺病毒,测序结果显示siRNA正确插入GV119,实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示Ad-siRNA-1-GILZ组的GILZ表达量最低,与空白对照组和阴性对照组相比,差异有统计学意义,其沉默效率为59.8%,重组腺病毒滴度为2.0×1010PFU/mL。  (3)Ad-siRNA-1-GILZ在Enhanced Infection Solution的感染效率为80%,MOI约为20。  (4)脓毒症血清诱导后,GILZ、MyHC的表达量减少,MyoD、myogenin的表达量增加,与对照组相比,差异有统计学意义。  结论:GILZ基因沉默增强脓毒症血清诱导成肌细胞的合成代谢。
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