辅料炮制是中药炮制的特色,能起到增效的目的。尽管相关研究不多,但显示辅料炮制能够促进中药有效成分的吸收,而相关作用及机制还有待深入。该领域研究为提高中药成分生物利用度以增强疗效、阐明辅料炮制原理,提供了有效的途径,因此具有重要意义。乳香为常用中药,醋炙具有增强疗效的作用。乳香酸类为乳香主要有效成分,抗炎活性确切。但该类成分的吸收程度低严重阻碍其临床疗效的发挥。研究证实,醋炙后乳香中2个乳香酸成分体内吸收显著增加,但吸收增加的本质尚未完全阐明。口服药物的物理性质是影响其吸收的关键因素。位于肝脏的转运体多药耐药相关蛋白 2(Multidrugresistance-associatedprotein2,MRP2)和有机阴离子转运1B3(Organic anion transporting polypeptide 1B3,OATP1B3)与乳香酸成分的吸收息息相关,而核受体组成性雄烷受体(Constitutive androstanereceptor,CAR)、法尼酯衍生物X受体(FamesoidXreceptor,FXR)和孕酮X受体(Progesterone X receptor,PXR)是调控转运体的重要因素。中药成分组成的改变会影响转运体的表达进而影响成分吸收。因此,推测乳香醋炙后物理性质的变化、化学成分的改变对转运体表达的影响,可能与醋炙后乳香酸类成分吸收增加进而增效有关。课题组前期就醋炙对乳香化学成分的影响开展了一些研究工作,发现乳香醋炙前后主要差异成分有18个,具有π-π共轭结构的9,11-去氢结构的乳香酸成分在醋炙后含量增加最为显著,且仅在醋乳香干预的大鼠血液中被检测到。研究显示该类成分具有较强的体外抗炎活性。其中3-O-乙酰基-9,11-去氢-β-乳香酸(3-acetyl-9,11-dehydro-β-boswellic acid,ADHBA)是含量最高的具 π-π 共轭结构的9,11-去氢结构的乳香酸成分。因此,在本研究的三、四章节,在对比乳香和醋乳香对药物转运体的调控作用中,单独设置了差异成分ADHBA组,以期更科学合理地说明成分变化对转运体调控进而影响吸收的机制。本研究以肠外翻模型确认醋炙对乳香酸肠吸收的影响;采用粉体学、流变学和生物药剂学指标,表征乳香醋炙前后与吸收相关物理性质的改变;研究醋炙前后及主要差异成分ADHBA对乳香酸吸收相关转运体OATP1B3、MRP2以及核受体CAR、FXR和PXR表达的影响,揭示乳香醋炙前后对核受体的调控差异进而影响相关转运体表达的机制。主要研究内容及研究结果如下:1醋炙对乳香中主要乳香酸成分肠吸收的影响研究乳香和醋乳香除了经溶剂提取后入药,2015版《中华人民共和国药典》收载的复方中多以原粉入药。为研究乳香醋炙前后主要乳香酸成分吸收变化,以乳香、醋乳香原粉以及它们的乙醇提取液为研究对象,采用大鼠外翻肠囊模型,利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术(Ultra-high-performance liquid chromatography coupled with a triple quadrupole electrospray tandem mass spectrometry,UHPLC-TQ-MS)建立乳香中6种主要乳香酸成分11-羰基-β-乳香酸(11-keto-β-boswellic acid,KBA)、3-乙酰-11-羰基-β-乳香酸(3-acetyl-11-keto-β-boswellic acid,AKBA)、α-乳香酸(α-boswellic acid,α-BA)、β-乳香酸(β-boswellic acid,β-BA)、3-乙酰-α-乳香酸(3-acetyl-α-boswellicacid,α-ABA)和 3-乙酰-β-乳香酸(3-acetyl-β-boswellicacid,β-ABA)的含量测定方法,进行了方法学考察,并分析肠囊液中它们的含量,计算肠吸收率。结果表明,所建立的方法稳定、可靠,适用于乳香酸成分肠吸收的研究。乳香醋炙后原粉和提取物中主要乳香酸KAB、AKBA、α-BA和β-BA的肠吸收率均升高,具有极显著性差异(P<0.01);且原粉中成分的肠吸收率增加值显著高于提取物的,具有极显著性差异(P<0.05)。由于α-ABA和β-ABA在乳香以及醋乳香原粉中含量非常低且吸收水平低,因此它们在所有肠囊液中均未检测到。结果提示,醋炙可以提高乳香原粉和提取物中主要乳香酸成分的肠吸收,且对原粉的促进作用强于对提取物的作用。2醋炙对乳香与吸收相关的物理性质的影响研究以乳香和醋乳香原粉为研究对象,采用扫描电子显微镜(Scanning electron microscopy,SEM)观察原粉表面形态,利用激光粒径仪测定粒径、多分散系数(Polymer dispersity index,PDI)和zeta电位,以压汞仪测定比表面积、孔体积以及孔隙率,考察乳香醋炙前后粉体学性质变化。在胃肠道模拟环境条件下,利用平氏毛细管粘度计测定乳香及醋乳香在人工胃液以及人工肠液的流出时间,考察醋炙对乳香粘性的影响。通过对pH=2.0、7.0和7.8-8.0时平衡溶解度的测定,考察乳香醋炙前后生物药剂学性质的变化。结果显示,乳香醋炙后,原粉粉体表面由光滑转为粗糙、充满褶皱和孔洞;粒径、PDI值显著减小(P<0.05或P<0.01);zeta电位绝对值、比表面积、孔体积以及孔隙率显著增大(P<0.05或P<0.01)。与乳香相比,醋乳香在人工胃液和人工肠液中流出时间显著减少(P<0.05或P<0.01),显示粘性降低。pH=2.0、7.0和7.8-8.0时,醋乳香中6种主要乳香酸成分KBA、AKBA、α-BA、β-BA、α-ABA以及β-ABA的平衡溶解度均显著高于乳香(P<0.05或P<0.01)。结果表明,醋炙能够改变乳香原粉表面形态,减小粒径和PDI值,增大zeta电位绝对值、比表面积、孔体积、孔隙率,进而增大乳香中主要乳香酸成分KBA、AKBA、α-BA、β-BA、α-ABA以及β-ABA的平衡溶解度。提示醋炙对乳香原粉与吸收相关物理性质的影响,均对其中乳香酸类成分的肠吸收过程有提高的作用。3乳香醋炙前后及主要差异成分对药物转运体的影响研究首先建立溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)大鼠模型,并通过疾病活动指数(Disease activity index,DAI)、结肠黏膜损伤指数(Colonic mucosal injury index,CMDI)和结肠组织学观察及评分(Histopathological score,HS)的观测与评分,病理切片表现以及细胞因子肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素 6(Interleukin-6,IL-6)的水平,评价疾病模型以及乳香醋炙前后功效的变化。然后,采用反转录-聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)技术及免疫印迹法,对给予乳香和醋乳香的UC大鼠肝组织中转运体MRP2 mRNA以及蛋白表达水平进行考察。并采用基于转运体高表达的人L02肝细胞,考察乳香醋炙前后及主要差异成分ADHBA对转运体MRP2、OATP1B3的mRNA以及蛋白表达水平的影响。结果表明,综合DAI、CMDI、HS、病理切片以及细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的观察及评测,以 2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonicacid solution,TNBS)诱导成功建立了UC大鼠模型。乳香和醋乳香均对UC具有一定的治疗作用,且醋乳香作用优于乳香。与正常组比较,UC模型大鼠肝组织中转运体MRP2 mRNA以及蛋白表达水平均降低(P<0.05或P<0.01)。经乳香和醋乳香干预后,显著上调了转运体MRP2的表达水平(P<0.05或P<0.01),且醋乳香作用显著高于乳香(P<0.05)。经乳香、醋乳香、主要差异成分ADHBA以及主要差异成分ADHBA+乳香干预后,L02肝细胞中转运体MRP2、OATP1B3的mRNA和蛋白表达水平均显著上调(P<0.05或P<0.01),醋乳香、主要差异成分ADHBA+乳香较乳香作用更加显著(P<0.05或P<0.01)。提示乳香醋炙后通过对化学成分的影响,增强对转运体MRP2及OATP1B3表达水平的上调作用,而乳香酸类成分转运体表达的增加反映了其肠吸收和肝肠循环过程中肝回收程度的提升。4乳香醋炙前后及主要差异成分介导核受体对药物转运体调控的机制研究采用反转录PCR技术及免疫印迹法,对给予乳香和醋乳香的UC大鼠肝组织和肠组织中核受体CAR、FXR和PXR的mRNA以及蛋白表达水平进行研究。并基于人L02肝细胞,考察乳香醋炙前后及主要差异成分ADHBA对核受体CAR、FXR以及PXR的mRNA表达水平的影响;分别利用核受体CAR、FXR和PXR的激动剂 CITCO(C19H12N30C13S)、GW4064(C28H22C13NO4)以及地塞米松(C22H29FO5),对比乳香醋炙前后及ADHBA对转运体表达的差异,以揭示乳香醋炙前后通过核受体CAR、FXR和PXR对乳香酸转运体MRP2和OATP1B3的调控机制。结果显示,与正常动物比较,UC模型大鼠肝组织和肠组织中核受体CAR、FXR和PXR的mRNA以及蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)。经乳香和醋乳香干预后,核受体CAR、FXR和PXR表达水平显著上调(P<0.05或P<0.01),且醋乳香较乳香作用更显著(P<0.05或P<0.01)。经乳香、醋乳香、主要差异成分ADHBA和主要差异成分ADHBA+乳香干预后,L02肝细胞中CAR、FXR和PXR的mRNA表达水平均显著上调(P<0.05或P<0.01),醋乳香、主要差异成分ADHBA+香比乳香作用更加显著。并且,采用激活剂CITCI、GW4064和地塞米松分别活化核受体CAR、FXR和PXR后,乳香酸吸收相关转运体MRP2和OATP1B3的上调表达程度均显著增加(P<0.05或P<0.01)。结论乳香醋炙后主要乳香酸成分肠吸收率显著提高,对UC大鼠治疗作用明显增强。一方面与醋炙对乳香吸收相关物理性质的改变有关,表现为醋炙改变乳香原粉表面形态、减小粒径和PDI值,增大zeta电位绝对值、比表面积、孔体积和孔隙率,从而增加溶解度促进乳香中主要乳香酸成分吸收。另一方面,与促进乳香酸吸收相关转运体的表达有关。表现为醋炙通过对乳香化学成分的改变更显著地上调核受体CAR、FXR和PXR的表达,进而使得参与乳香酸类成分吸收过程的转运体MRP2和OATP1B3上调幅度显著增加。