急性肝衰竭时，脑内氨浓度可升高至毫摩尔浓度水平。在脑内，星形胶质细胞对肝衰竭及升高的氨浓度更为敏感。有研究称慢性氨刺激星形胶质细胞增加哇巴因样物质的生成及Na，K-ATP酶的活性。Na，K-ATP酶由α及β亚单位组成，其中的α亚单位跨过细胞膜数次，具有Na+、K+、ATP及其特异性抑制剂哇巴因的结合位点。β亚单位为单次跨膜的糖蛋白，其大部分区域暴露于细胞外空间。α亚单位存在有四种亚型，即α1、α2、α3及α4。在成年脑及培养的中枢神经系统细胞，α1亚型在星形胶质细胞及神经元中均有表达，α2亚型主要在星形胶质细胞中表达，而α3亚型只在神经元中表达。鉴于哇巴因长时刺激上调培养的大鼠星形胶质细胞α2亚型的事实，推测氨刺激增加星形胶质细胞内Na，K-ATP酶活性可能是其增加哇巴因样物质生成的结果。不知何故，大鼠星形胶质细胞培养物并不表达α2亚型。我们在之前的研究中发现，氨刺激可选择性上调小鼠星形胶质细胞α2亚型的基因表达，但对α1亚型的表达并无影响。　　除了抑制Na，K-ATP酶活性的活性，低浓度的哇巴因(0.1-1 nM)可以在不影响α1亚型泵活性的情况下，作为配体与α亚单位结合后，引起表皮生长因子受体的转激活。经典的EGF受体转激活的过程为:在外界刺激如去极化、Gi/o或Gq蛋白偶联受体激活或胞浆内钙浓度([Ca2+]i)增加时，引起由Zn2+依赖性金属蛋白酶催化的EGFR配体的释放，从而导致自身及邻近细胞EGFR的转激活，并接下来激活其下游的两个主要的细胞内信号通路:MAPK/ERK和PI3K/AKT通路。而哇巴因与α1受体的结合后会招募Src，继而Src磷酸化EGFR，启动其信号转导通路。该过程发生于脂筏内，并需要脂筏内的主要成份小窝蛋白的参与。除了α1亚型，在中枢神经系统NaC1超载的高压模型中，α2亚型也可作为哇巴因的受体。氨刺激星形胶质细胞α2亚型表达上调，该作用可被EGFR的阻断剂AG1478及Src的阻断剂PP1所抑制，而不受金属蛋白酶抑制剂GM6001的影响，表明该过程中EGFR的磷酸化是Src直接刺激的结果，而不涉及生长因子的水解释放。　　肝衰竭病人常伴有脑水肿，这是引起病人死亡的常见原因。而肝衰竭病人脑水肿主要是星形胶质细胞水肿的结果。氨刺激培养的星形胶质细胞可以诱导其水肿。氨刺激引起星形胶质细胞水肿的机制不明，最近的研究发现MAPK/ERK可能参与了该过程。　　我们拟通过本实验探讨①EGFR抑制剂AG1478、Src抑制剂PP1及金属蛋白酶抑制剂GM6001对氨刺激引起的ERK磷酸化的影响;②氨刺激对EGFR磷酸化位点的影响;③Na，K-ATP酶α1或α2亚型、Src及小窝蛋白-1在氨所致EGFR转激活中的作用;④氨刺激对星形胶质细胞AKT信号通路的影响。⑤Src、小窝蛋白-1、EGFR及ERK在氨所致细胞水肿中的作用。　　方法：　　本研究以原代培养小鼠星形胶质细胞为实验对象，进行如下实验:①以蛋白质免疫印迹方法为手段，分别检测EGFR抑制剂AG1478、Src抑制剂PP1及金属蛋白酶抑制剂GM6001对氨刺激引起的ERK磷酸化的影响;②利用蛋白质免疫沉淀技术，检测氨刺激对EGFR磷酸化位点的影响;③利用免疫共沉淀技术研究氨对EGFR、Na, K-ATP酶α1或α2亚型、Src、ERK、小窝蛋白-1间相互作用及Src与EGFR Tyr845位点间相互作用的影响;④利用RNA干扰技术探讨小窝蛋白-1在氨致ERK活化中的作用;⑤利用RNA干扰技术探讨小窝蛋白-1在氨致AKT活化中的作用;⑥利用蛋白质免疫印迹技术探讨AKT信号通路对氨所致ERK活化的影响。⑦以Calcein作为荧光指示剂，探讨Src、小窝蛋白-1、EGFR及ERK在氨所致细胞水肿中的作用;使用SPSS12.0软件进行统计学分析，多组资料用one-way ANOVA方法进行比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。　　实验结果：　　1、氯化铵引起的星形胶质细胞内ERK1/2活化有EGFR及Src参与，但没有金属蛋白酶的参与　　星形胶质细胞经3mM氯化铵20 min的刺激后，引起了较弱的，但有统计学意义的ERK磷酸化。随着刺激时间的延长，其磷酸化水平在1h后达到了对照水平的150％，2-4小时后则达到近200％。EGFR阻断剂AG1478(1μM)及Src的阻断剂PP1(10μM)完全抑制了氨对ERK的刺激作用，但金属蛋白酶的抑制剂GM6001(10μM)并不影响氨对ERK的作用，表明EGFR及Src参与了氨所致的ERK磷酸化，而金属蛋白酶并不参与该过程。　　2、氯化铵刺激引起星形胶质细胞EGFR磷酸化　　星形胶质细胞经3mM氯化铵20分钟的刺激后，其EGFR的两个磷酸化位点Tyr45和Tyr1068的磷酸化水平明显增加，而其Tyr92、Tyr1045及Tyr1173的磷酸化水平并未发生改变。　　3、氯化铵刺激引起EGFR磷酸化的信号转导通路　　在利用小窝蛋白-1特异性抗体进行的免疫共沉淀实验中发现，3 mM氯化铵20分钟的刺激能促进EGFR、Na, K-ATP酶α1亚型、Src及ERK与小窝蛋白-1相互作用，而Na, K-ATP酶α2亚型并不参与该过程。而且还发现，氨能刺激Src与EGFRTyr845位点的结合。利用小窝蛋白-1特异性siRNA处理星形胶质细胞3天后，明显抑制了3 mM氯化铵对ERK的刺激作用。　　4、氨所致AKT活化没有小窝蛋白-1的参与，但PI3K/AKT信号通路能影响ERK的活化　　氨刺激明显引起了星形胶质细胞AKT的磷酸化，但小窝蛋白-1siRNA并未影响AKT的活化，表明其活化机制有别于ERK。但氨诱导的ERK磷酸化不但能够被MEK/ERK的抑制剂U0126及PD98059所抑制，还可以被PI3K/AKT信号通路的抑制剂LY294002及wortmannin所抑制，表明PI3K/AKT信号通路能够影响氨对MEK/ERK的活化。　　5、EGFR、Src、ERK及小窝蛋白-1参与了氨所致星形胶质细胞水肿　　星形胶质细胞经3mM氯化铵刺激12小时后发生了明显的水肿，其体积约为对照水平的120-140％，氨对星形胶质细胞水肿的刺激作用可被EGFR抑制剂AG1478、Src抑制剂PP1及MAPK抑制剂U0126所阻断。不出所料，其也可以被小窝蛋白-1的特异性siRNA所抑制，但金属蛋白酶抑制剂GM6001对氨所致星形胶质细胞水肿并无影响。　　讨论：　　脑水肿是急性肝性脑病中常见的严重并发症，其往往引起患者的颅内压升高及脑疝。氨在肝性脑病的发病机制中起着重要作用。肝衰竭中最易受到伤害的是星形胶质细胞。在各种神经病理中常常可以见到星形胶质细胞的功能异常。高浓度氨刺激会诱发星形胶质细胞水肿。氨诱导星形胶质细胞水肿涉及多种机制，其中包括最近提出的MAPK/ERK信号通路。　　目前对氨致MAPK/ERK信号通路活化的机制报道不多。我们之前的研究发现氨刺激星形胶质细胞α2亚型表达上调，该作用可被EGFR的阻断剂AG1478及Src的阻断剂PP1所抑制，而不受金属蛋白酶抑制剂GM6001的影响，表明在氨的刺激下，星形胶质细胞中有EGFR的转激活，且该转激活是Src直接刺激的结果，而不涉及生长因子的水解释放。我们现在的研究则发现，氨对MAPK/ERK信号通路的活化同样涉及上述机制。而且，氨对MAPK/ERK信号通路的活化在时间上远早于其对α2亚型表达的上调(20 min vs1-4 d)。可见氨对Src-EGFR-MAPK/ERK的级联活化是其引起星形胶质细胞损伤的一个重要的早期事件。　　EGFR中包含有几个参与其活化的酪氨酸磷酸化位点。为了进一步证实氯化铵刺激对星形胶质细胞的EGFR转激活，我们利用免疫沉淀及免疫印迹技术对氯化铵刺激下EGFR的5个磷酸化位点(Tyr845、Tyr992、Tyr1045、Tyr1068和Tyr1173)磷酸化水平的变化进行了研究。我们发现虽然磷酸化位点Tyr992、Tyr1045及Tyr1173的磷酸化水平并未受氯化铵的影响，但氯化铵却可以显著增加EGFR在Tyr845及Tyr1068两个位点上的磷酸化。总之，上述实验结果表明，高氨刺激能够通过EGFR转激活的方式激活星形胶质细胞内的信号级联，其中包括其下游的MAPK/ERK通路。　　有研究称慢性氨刺激星形胶质细胞增加哇巴因样物质的生成及Na, K-ATP酶的活性。Na，K-ATP酶是位于细胞膜上的蛋白质，其主要功能主要表现在两方面。一方面，作为离子转运系统以维持跨膜的Na+和K+梯度。另一方面，Na，K-ATP酶还可作为强心甾体类物质的受体以介导哇巴因及其它的内源性地洋地黄样物质对细胞的效应。Na，K-ATP酶主要由具有催化活性的α亚单位及糖基化的β亚单位组成。而其中的α亚单位是传递哇巴因信号时起主要作用的多肽。目前已有很多关于Na, K-ATP酶介导的信号的研究。有报道发现在细胞中存在有两大类群的Na，K-ATP酶，其中位于富含胆固醇的胞浆膜小窝中的Na, K-ATP酶与其信号转导功能有关。在小窝中，Na，K-ATP酶可以与其它蛋白组成复合物的形式实现其信号转导功能。在与哇巴因结合后，Na，K-ATP酶与邻近的蛋白相互作用，继而导致Src、EGFR及其下游MAPK/ERK通路的活化。该过程需要小窝中主要成分小窝蛋白-1的参与。　　我们推测氨诱导的EGFR转激活可能与其增加星形胶中质细胞内哇巴因样物质的生成有关。为验证这个推论，我们在本实验进行了几个重要的观察。我们首先发现，氨刺激可以促进星形胶质细胞中EGFR、Na，K-ATP酶α1、Src、ERK及小窝蛋白-1间相互作用，表明氨诱导的EGFR转激活也需要通过各个分子在小窝中组成复合物，以促进分子间的相互作用来实现。需要指出的是，虽然在中枢神经系统NaCl超载的高压模型中，α2亚型也可作为哇巴因的受体。但在我们的实验中，Na, K-ATP酶α2亚型没有参与氨刺激下各个信号分子间的相互作用，表明畦巴因在介导氨信号时是以Na，K-ATP酶α1为其受体的。的确，多数情况下Na,K-ATP酶信号转导功能都是通过α1亚型实现的。　　接着，在利用Src抗体进行的免疫共沉淀实验中我们发现，氨可以显著增强Src与EGFR Tyr845位点间的相互作用。这样看来，氨对EGFR Tyr845位点的磷酸化是Src激活的结果。的确，已经证实Tyr845是一个Src相关的靶点，而且在哇巴因介导的EGFR转激活中，Src可引起Tyr845位点的磷酸化。这进一步证实了在氨的刺激下，星形胶质细胞中存在有Src依赖的EGFR转激活。　　最后，为证明小窝蛋白-1确实与氨信号有关，我们利用RNA干扰技术降低细胞中小窝蛋白-1的表达后发现，氯化铵刺激不再能引起ERK的活化。表明小窝蛋白-1在氨刺激引起的信号转导中起着举足轻重的作用。　　上述事实表明，氨诱导的EGFR转激活及其下游的信号级联反应极有可能是其增加星形胶中质细胞内哇巴因样物质的生成的结果。的确，氨可以影响星形胶质细胞中许多蛋白的功能，包括外周型苯二氮卓类受体、胶质纤维酸性蛋白、葡萄糖转运体、谷氨酸转运体、甘氨酸转运体及水通道蛋白-4等。其中，外周型苯二氮卓类受体是星形胶质细胞表达的与肝性脑病密切相关的蛋白质。该受体激活后能诱导星形胶质细胞孕烯醇酮神经甾体的生成。值得注意的是，在肝性脑病实验动物模型及临床病人中，体内神经甾体均有升高。而孕烯醇酮正是哇巴因样物质合成的前体。虽然哇巴因介导氨信号的可能性有待进一步验证，但我们现在的实验揭示氨刺激星形胶质细胞诱导的EGFR转激活及其下游信号转导与其促进各个相关的信号分子在小窝中相互作用有关。　　除了激活MAPK/ERK外，哇巴因往往还可引起PI3K/AKT通路的活化。我们在对氨信号的研究中也发现了其对AKT的磷酸化激活。但意外的是，氨对星形胶质细胞AKT的活化时似乎有别于MAPK/ERK。氨对AKT的活化作用并不依赖于小窝蛋白的参与。我们推测氨对PI3K/AKT信号通路的影响可能并不像其激活ERK那样，借助于小窝中信号复合物内分子间的相互作用。但这两个信号通路也并非毫无关系，因为PI3K/AKT通路的特异性抑制剂(LY294002和wortrnannin)能够阻断氨对MAPK/ERK的活化，表明PI3K/AKT通路同样参与了氨刺激下星形胶质细胞ERK的活化。上述关于氨对PI3K/AKT通路的影响只是我们的初步研究，尚有许多问题有待阐明，至少包括以下几个方面:1）PI3K/AKT与EGFR转激活的关系，即PI3K/AKT激活是否是EGFR转激活的结果;2）MAPK/ERK是否反过来也影响PI3K/AKT通路的活化;3) PI3K/AKT和MAPK/ERK间的相互作用机制如何，即两者间的对话发生在什么水平;4）PI3K/AKT是否也参与氨引起的星形胶质细胞水肿。目前，我们正在对此进行研究。　　值得注意的是，上述EGFR转激活通路中的各种关键分子与氨诱导的星形胶质细胞水肿有着密切的关系。提示通过早期转激活EGFR，氨能够使星形胶质细胞在后期发生许多重要的改变，包括我们之前发现的Na，K-ATP酶α2上调及现在发现的细胞水肿。既然星形胶质细胞水肿是肝性脑病的主要病理改变，上述信号通路的阐明无疑对该病的治疗具有重要意义。　　结论：　　在肝性脑病中，病理浓度的氨可以增强EGFR、Na，K-ATP酶α1亚型、Src、ERK及小窝蛋白-1间的相互作用，继而促进Src对EGFR的转激活。转激活的EGFR则进一步激活其下游的Ras-Raf-MEK-ERK信号通路，并最终引起星形胶质细胞的水肿。