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N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GnT-V)(EC.2.41.155)是分布在高尔基体中的一种重要的N-糖链加工酶，它以UDP-GlcNAc为供体底物，将GlcNAc基团转移至受体N-糖链核心α1，6臂的甘露糖(Man)上，形成GlcNAcβ1，6Man分支结构，主要分布在小肠，脑和肺等组织。人类GnT-V由741个氨基酸组成，有6个潜在的N-糖基化位点，基因定位于染色体2q21，含有17个外显子，其开放阅读框架由外显子2-17进行编码。GnT-V在很多恶性肿瘤中部有过量表达，其产物复杂型N-糖链β1，6GlcNAc分支的增多可能是肿瘤发展和转移潜能的重要特征。本实验室对GnT-V的研究已有多年，但我们发现GnT-V的功能尚有很多问题未解决。本文以稳定转染GnT-V正义或反义cDNA质粒的H7721人肝癌细胞为材料，从下列四个方面对GnT-V影响信号转导及其机制以及引起基因表达的变化进行了研究，企图阐明糖基转移酶转染是怎样调节细胞信号转导的?而细胞信号转导的改变是否与细胞表面某些受体的糖链结构的改变(由GnT-V的正义或反义cDNA转染引起的)有关?能否影响细胞基因表达?这些问题的阐明不仅有利于进一步认识GnT-V的功能，而且为肿瘤转移的分子机理提供有价值的资料。 第一部分 GnT-V对H7721细胞生长、EGF敏感性和EGF受体的影响 用MTT方法发现转染正义GnT-V cDNA的H7721细胞增殖速度加快，而且无论是~3H-TdR的总参入量或每个细胞的参入量均见增加，说明DNA合成增强，而转染反义GnT-VcDNA的H7721细胞则完全相反，DNA合成和细胞增殖速度均见降低，这提示GnT-V可调节细胞的生长。GnTV-S／H7721细胞的生长对表皮生长因子(EGF)刺激比Mock细胞敏感，而GnTV-AS／H7721细胞对EGF敏感性则低于Mock细胞。因此本文对不同转染细胞EGF受体(EGFR)的糖链结构及功能的改变作进一步研究，结果发现，不同转染细胞中，免疫沉淀EGFR的蛋白量没有改变，但GnTV-S／H7721细胞EGFR上N-糖链中β1，6 GlcNAc分支比Mock细胞增多，而GnTV-AS／H7721细胞相反。随着EGFR上N-糖链的变化，其配体结合与自身酪氨酸磷酸化也相应改变，GnTV-S／H7721细胞对EGF亲和力和自身酪氨酸磷酸化增强，而GnTV-AS／H7721细胞这两方面能力都减弱。由此可见不同GnT-VcDNA转染后引起的DNA合成和细胞增殖速度的变化的原因之一很可能是EGFR糖链结构和功能的改变，而EGFR糖链β1，6GlcNAc分支增加有利于和EGF的结合及随之引起的酪氨酸磷酸化，而EGFR糖链田，6口cNAc分支减少则不利于上述过程。第二部分G nT-V对H7721细胞中EGF受体信号转导分子磷酸化 及活力的影响 EGFR的结构与功能被转染的正义或反义GnT一V cDNA改变后，可能会进一步引起下游信号分子磷酸化或活力的改变。EGFR的信号通路主要有两条，一是Ras-raf-MEK一MAPK经典途径，另一条是新发现的PI一3K一PKB途径。本部分对GnT’V-S/H7721和GnTv一As/H7721细胞这两条通路中一些关键信号分子的磷酸化及/或活力变化进行了研究。用特异性抗体结合Westem blot结果发现，正义或反义GnT一V cDNA的转染并不引起PKB、p44/42MAPK和MEK蛋白质表达的变化，而GnTv一S/H”21细胞PKB T308、5473位点磷酸化和免疫沉淀PKB的酪氨酸磷酸化以及以GSK召a/日磷酸化为指标的PKB的活性都较Mock细胞增加，GnTV一AS/H7721细胞中这些指标的变化则相反。GnTV一S/H7721细胞p42/4 4 MAPK的磷酸化也较Mock细胞增强，而GnTV一AS舰7721细胞则减弱，表明EGFR的这两条信号通路中信号分子的磷酸化或活力都受GnT一V的影响。为了研究这两条信号通路中信号分子磷酸化或活力改变与EGF的关系，我们用EGF短时间刺激血清饥饿的细胞，结果发现，当细胞血清饥饿12小时后，PKB活力和p42/4 4 MAPK磷酸化明显减少至无法检测出，但MEK磷酸化仍可测出。EGF刺激后不同转染细胞中的PKB活性、p42/44 MAPK和MEK磷酸化都明显增加，其中GnTV一S/H 7721细胞PKB比活性、p42/4 4 MAPK和MEK磷酸化程度较Mock细胞增加明显，而GnTV一AS/H7721细胞中上述指标的增加程度则不及Mock细胞。为了研究PKB活性、P42/44 MAPK磷酸化与N一糖链的关系，我们用N一糖链合成抑制剂衣霉素处理细胞后，发现不同转染细胞中PKB活性和p42/.44MAPK磷酸化都普遍降低，而且它们在不同转染细胞间的差别减小:衣霉素处理细胞后再用EGF刺激细胞，不同转染细胞的PKB活性都略为增高，但不及未用衣霉素处理者明显，且在不同转染细胞之间的PKB活性差别几乎消失。由此可见，PKB的基础活性和p42/44 MAPK的基础磷酸化及外源性EGF刺激细胞后所引起的PKB活性诱导性升高也与N一糖链有关。为了研究PKB活性和P42/4 4 MAPK磷酸化与EGFR的关系，采用EGFR抗体处理细胞后，发现不同转染细胞中PKB活性和p42/44 MAPK磷酸化的差别也减小，表明EGFR的N一糖链参与了其下游的信号转导。本部分从正反两个方向均证实由正义或反义Gn丁一v的转染引起的EGFRN一糖链结构改变对E〔净的信号转导起重要的调节作用。第三部分G nT一V对整联蛋白表达、糖链结构的影响及其与PKB磷酸化的关系 整联蛋白是细胞膜上另一个与PKB磷酸化(5473)有关