生防腐霉抑菌或诱导细胞死亡的效应子筛选及作用机制探索

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腐霉菌属卵菌门腐霉科,多为腐生性植物病原菌,但有些腐霉不仅不是植物病原菌,还能抑制其他病原菌对植物的侵染且促进植物生长,寡雄腐霉(Pythium oligandrum)和缠器腐霉(Pythium periplocum)就是这样具有生防作用的腐霉菌。寡雄腐霉和缠器腐霉是非致病性的土壤习居型卵菌,存在于多种作物的根系生态系统中,在与植物接触过程中可以诱导植物产生对病原菌广泛、长期的抗性,还对多种病原菌具有拮抗或寄生作用,同时还能促进植物生长。寡雄腐霉的主要生防机制有重寄生作用、分泌抗生物质、竞争作用、促进植物生长、诱导植物抗性。近年来,一些能被寄主植物细胞表面的模式识别受体(Pattern Recognition Receptor,PRRs)识别而触发植物免疫反应的病原相关分子模式(Pathogen-associated Mocular Patterns,PAMPs)和质外体效应子被鉴定出来。然而,作为生防效果突出的生防腐霉,寡雄腐霉和缠器腐霉是否能通过分泌效应子来抑制植物微生物环境中其他病原菌以及诱导植物产生抗性来发挥其生防作用,目前尚不清楚。本文中,我们对寡雄腐霉和缠器腐霉的效应子进行了筛选:通过大肠杆菌诱导表达系统,鉴定到一系列能抑制细菌生长、具有潜在抑菌作用的效应子;利用烟草瞬时表达系统,鉴定到了一批能诱导植物细胞死亡、具有潜在诱抗活性的质外体效应子。主要研究内容如下:在卵菌大量效应子中,只有少部分能与植物互作发挥功能,其他大量效应子的功能还未知。除了与植物互作外,生防腐霉分泌的部分效应子能否抑制植物微环境中微生物的生长来使自己获得更多生态位?在与丝状病原菌互作过程中,寡雄腐霉会产生类似吸器的结构侵入到病原菌中,这一现象类似于病原卵菌通过产生吸器将效应子分泌到寄主植物细胞中而干扰寄主免疫反应,因此我们利用生物信息学分析鉴定了寡雄腐霉和缠器腐霉的胞内CRN、RxLR家族效应子,将其克隆、构建到pBAD大肠杆菌诱导表达载体上,通过阿拉伯糖诱导表达,在寡雄腐霉中鉴定到了5个能够抑制大肠杆菌BL21生长的效应子。此外,这5个效应子均不能引起本氏烟草的细胞死亡。通过进一步的生物信息学分析,我们发现抑菌效应子寡雄腐霉PoAvh19有一个重复串联的TSP1结构域,已有研究表明卵菌中此结构域与粘附作用有关,为后续机制研究提供了思路。本研究从一个全新的角度出发,探索卵菌效应子在与植物微环境中其他微生物互作过程中能否发挥作用,借助大肠杆菌诱导表达系统,鉴定到了一批具有潜在抑菌作用的效应子,拓宽了效应子的生物学功能,为今后研究卵菌与植物微环境中微生物的互作提供了思路,也为开发新型的绿色杀菌剂、应用绿色防控技术防治病害提供了理论基础。寡雄腐霉和缠器腐霉基因组编码了大量质外体效应子,为了筛选潜在的免疫诱抗蛋白,本研究结合文献报道选择了 NLP(Nep1-like proteins)家族、Elicitin家族和CBEL(Cellulose-binding elicitor lectin)家族作为候选。首先,我们对三类质外体效应子家族进行生物信息学分析,分别鉴定到了 27个NLP、116个Elicitin和50个CBEL蛋白基因。接下来,利用农杆菌介导的瞬时表达系统,将诱导本氏烟草细胞死亡作为筛选指标,我们鉴定到了 7个能够诱导细胞死亡的质外体效应子,其中有6个属于NLP家族、1个属于Elicitin家族。本研究通过筛选免疫诱抗蛋白,为今后解析诱抗分子机制、开发与应用基于生防腐霉的绿色免疫诱抗新技术提供了有力支撑。
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