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洋川芎内酯Ⅰ(SenkyunolideⅠ，SEⅠ)是从传统中药川芎中提取分离得到的一种苯酞类化合物。本课题组前期研究发现，SEⅠ是川芎及大川芎方主要的入血、入脑成分，药动学研究结果表明SEⅠ吸收迅速且可快速进入脑实质，其体内生物利用度较高，半衰期短;药效学研究发现，SEⅠ对大鼠偏头痛和局灶性脑缺血再灌注损伤均有一定的改善和治疗作用;作用机制研究结果表明SEⅠ可调节5-羟色胺(5-HT)、一氧化氮(NO)、降钙素基因相关肽(CGRP)及β-内啡肽(β-EP)等内源性递质，SEⅠ对脑缺血引起的氧化应激损伤和细胞凋亡也具有一定的抑制作用。本文旨在以前期工作为基础，分别从细胞水平、动物水平和分子水平深入研究SEⅠ跨血脑屏障的转运特征及其对脑卒中的保护作用机制，为进一步明确SEⅠ的作用靶点、以及抗脑卒中的新药开发提供参考。 1.SEⅠ在体外血脑屏障模型上的转运特征 本文选择MDCK-MDR1细胞系建立体外血脑屏障(Blood brain barrier, BBB)模型，通过罗丹明123摄取实验和Transwell双向转运实验研究SEⅠ跨BBB转运机制。结果发现安全浓度范围内的SEⅠ(10-100μg/mL)对P-糖蛋白(P-gp)底物罗丹明123(Rho123)的摄取无明显调节作用;此外，SEⅠ对血脑屏障模型的跨膜电阻值(TEER)和荧光素钠(NaF)的渗透系数均无显著性影响;Transwell双向转运实验证明SEⅠ的累积释放量在10-100μg/mL浓度范围内随初始浓度递增，且在180 min内随时间线性增加，无饱和时间点。综上，初步证明SEⅠ对体外BBB通透性无明显调节作用，其跨血脑屏障的转运机制可能为被动扩散且无P-糖蛋白的参与。 2.SEⅠ对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠模型的保护作用 本文采用大鼠脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型，通过尾静脉注射给药考察SEⅠ对大鼠MCAO模型的脑保护作用。结果发现9-18 mg/kg的SEⅠ与溶剂组相比，能显著性地降低脑相对梗死体积并改善神经功能缺陷。随着SEⅠ给药剂量的增加(～72mg/kg)，给药组动物死亡率递增。以上实验结果提示我们，低剂量的SEⅠ对MCAO大鼠有一定的保护作用，而高剂量SEⅠ对脑损伤大鼠可能存在毒性，这可能与脑组织病变后BBB被破坏致SEⅠ在脑实质大量蓄积有关。 3.SEⅠ对氧糖剥夺/复糖复氧诱导的小胶质细胞的炎症反应的抑制作用及其机制 本文通过对小胶质细胞BV-2细胞系和大鼠原代皮层小胶质细胞进行氧糖剥夺和复糖复氧的处理(Oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)建立小胶质炎症模型，并考察SEⅠ预处理对其炎症的抑制作用及作用机制。结果发现，SEⅠ(100μM)预处理对OGD/R所致的BV-2细胞形态学改变有明显的改善作用;细胞毒性实验结果表明，SEⅠ(1-100μM)对OGD/R所致的BV-2细胞存活率降低无明显缓解效果;分子生物学实验结果表明较高浓度的SEⅠ(50-100μM)能显著抑制OGD/R诱导的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6和干扰素-γ(IFN-γ)的mRNA的形成以及上述促炎细胞因子和NO的释放，SEⅠ对环氧合酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的转录和翻译也有一定的抑制作用。信号通路研究结果发现SEⅠ可浓度依赖性地抑制小胶质细胞中NF-κB信号通路的激活，其表现为下调IKKα/β、IκBα和NF-κB p65的磷酸化水平，从而抑制胞浆中IκBα的降解和随后的NF-κB转位入核。报告基因实验和凝胶阻滞迁移电泳实验证明SEⅠ可抑制NF-κB的转录活性及其与DNA的结合，而SEⅠ并不影响MAPK信号通路的激活。研究还发现SEⅠ可抑制Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的表达升高。此外，作为TLR4的内源性配体，诱导型热休克蛋白70在脑缺血的相关研究中表现出一定的保护作用。本实验发现OGD/R明显地激活了热休克转录因子-1(HSF-1)与hsp70基因启动子区热休克元件(HSE)的结合以及其下游Hsp70的转录和表达，而SEⅠ可以进一步增强这种作用。我们还通过小干扰RNA技术和“圈套”核苷酸(Decoy oligonucleotides)策略技术发现SEⅠ对TLR4/NF-κB通路的抑制作用被此削弱或逆转，提示SEⅠ的此抗炎作用与HSF-1/Hsp70的激活相关。最后，我们通过原代小胶质细胞OGD/R模型证实上述发现。综上证明SEⅠ可以抑制OGD/R诱导的小胶质细胞的炎症反应，其机制与HSF-1/HSP70/TLR4/NF-κB信号通路有关。 4.基于双报告检测系统的川芎内酯类化合物及其类似物体外抗炎活性筛选 本文通过瞬时转染的方法将NF-κB萤火虫萤光素酶报告质粒和海肾萤光素酶报告质粒转入BV-2细胞，通过OGD/R刺激并加入待筛选的洋川芎内酯类化合物进行干预，然后检测萤光素酶活性来反映NF-κB激活程度，以此筛选出具有抑制NF-κB激活作用的化合物。结果发现1～10μM的欧当归内酯A和100μM的洋川芎内酯Ⅰ均能明显地抑制NF-κB激活。并通过构效关系的初步解析，认为其3位正丁烯基、6/7位取代以及二聚体化可能更利于其发挥抗炎活性。