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哺乳动物精卵融合属于细胞膜融合的一种，它包括很多复杂的步骤，是精卵细胞上多种蛋白因子相互识别、相互作用并且逐渐发生反应的过程。迄今文献报道在卵子和精子上分别鉴定出若干种与精卵融合相关的蛋白因子，卵子上有JUNO、CD9、CD81和GPI-Aps等，精子上有PDIA3、CRISP2、CRISP1、SLLP1、Equatorin及Izumo1等，但在精卵融合过程中，这些蛋白质分子究竟以何种方式参与了此过程，目前仍然不完全清楚。本实验选取了大鼠的CRISP2和PD[A3为研究对象，研究精子表面的蛋白之间的相互作用，为解析哺乳动物精卵融合的分子机制提供线索。 我们在Ensembl数据库（http://www.ensembl.org/index.html）查询分析大鼠Crisp2(ENSRNOG00000013225)和Pdia3(ENSRNOG00000015018)的cDNA序列，设计实验所需引物;用RT-PCR方法克隆大鼠Crisp2和Pdia3的cDNA序列，构建pET32a-Crisp2和pGEX4T-1-Pdia3原核表达载体，制备小鼠抗大鼠CRISP2和PDIA3的多克隆抗体，用免疫组织化学和免疫细胞化学技术研究CRISP2和PDIA3蛋白在大鼠睾丸和精子项体反应前后的表达定位。 实验结果表明大鼠CRISP2和PDIA3蛋白大量出现于其睾丸曲精细管内侧至中央区，即大鼠精子发生和成熟精子出现的区域。免疫细胞化学结果显示:在顶体反应前的大鼠精子细胞中，CRISP2蛋白位于整个大鼠精子上，而大鼠PDIA3蛋白主要存在于精子头、体部，在尾部只有少量分布;项体反应后大鼠CRISP2存在于精子体、尾部;而大鼠PDIA3发生顶体反应后从精子上消失了。 实验克隆到的大鼠Crisp2和Pdia3 cDNA长度分别为730 bp、1497 bp，编码243个氨基酸（amino acid简写为:aa，以下类同）和499个氨基酸，N端分别有22 aa和24 aa个氨基酸的信号肽。将克隆得到的大鼠Crisp2和Pdia3 cDNA的成熟肽亚克隆，并按照其多肽结构域分为A、B两段，分别与酵母双杂交载体pGAD和pGBKT相连，构建了分段pGAD-Crisp2A、pGAD-Crisp2B、pGBKT-Pdia3A、pGBKT-Pdia3B及成熟肽全长pGAD-Crisp2、pGBKT-Pdia3酵母双杂交载体，分组进行酵母双杂交，分析各段多肽之间的相互作用。同时也与真核载体pcDNA3.1相连，构建了分段pcDNA-Crisp2A、pcDNA-Crisp2B、pcDNA-Pdia3A、pcDNA-Pdia3B及成熟肽全长pcDNA-Crisp2、pcDNA-Pdia3表达载体。把上述的载体成对组合，共转染293T细胞，待表达目的蛋白后，进行免疫共沉淀和Western blot分析CRISP2和PDIA3多肽片段之间的相互作用。 实验结果显示大鼠PDIA3-CRISP2成熟肽存在相互作用，各分段中CRISP2A-PDIA3A、 CRISP2A-PDIA3B之间亦存在相互作用;CRISP2B-PDIA3A、CRISP2B-PDIA3B之间不存在相互作用。