目的:本研究通过对双黄连制剂的化学成分表征、指纹图谱建立、体内外药效学实验、大数据谱效相关分析以及多组学联合等研究,阐明双黄连制剂抑菌抗病毒的药效物质基础,揭示其组方配伍规律,探寻该药物的作用靶点及作用机理,进而,建立谱-效相关质量评价系统,并对组方进行优化加减,为中药新药研发提供技术支撑。方法:1.收集不同厂家不同批次的双黄连口服液共计50批,不同产地、厂家和批次的金银花、黄芩和连翘各10批,原药材按照2015版《中国药典》双黄连口服液制备方法,分别制备双黄连制剂复方、拆方以及各单味药制剂共计70批。在课题组前期对双黄连口服液研究的基础上,建立双黄连制剂的LC-QTOF/MS的指纹图谱测定方法,筛选共有峰并对其进行定性和相对定量。2.以金黄色葡萄球菌和呼吸道合胞病毒为研究对象,进行体内外抗RSV和体外抑菌的药效学实验。体内抗RSV以小鼠体重、脏器指数、肺组织病理切片以及不同的炎性因子为检测指标;体外抗RSV以治疗指数(TI)为指标;体外抑菌以抑菌率为指标,判断双黄连制剂的体内外药效。3.采用灰色关联度分析结合偏最小二乘回归分析方法,对不同配伍方式的双黄连制剂中药效物质进行敏感度和贡献度分析,探寻双黄连制剂中针对不同药理实验发挥关键作用的化学成分,从而推断该复方的君、臣配伍关系。另外,采用最小二乘支持向量机(LS-SVM)法建立双黄连制剂的谱-效相关质量评价系统。4.采用LC-MS/MS技术分别对小鼠的肺组织进行蛋白质组学和代谢组学分析,使用R语言、XCMS、SPSS以及SIMCA-P等对数据进行处理,分析小鼠肺组织中蛋白质和内源性代谢物的差异性变化,筛选差异性蛋白以及潜在的生物标志物,探寻双黄连制剂体内抗RSV的作用靶点和机理。结果:1.通过标准品对照,一级和二级质谱信息解析以及结合文献报道,对双黄连制剂复方制剂中的93个成分进行了初步定性,其中45个来源于金银花,26个来源于黄芩,22个来源于连翘,明确了双黄连制剂的药效物质基础;并对双黄连制剂中的48个出峰稳定、线性良好的物质峰进行了相对定量。2.采用PLS建模综合评价不同双黄连制剂体内抗RSV的药效结果显示,RSV小鼠模型复制成功,体重、脏器指数、肺组织病理切片、炎性因子等各项药理指标显示模型组小鼠病变严重,经不同配伍的双黄连制剂干预后均出现不同程度的回调状态,其中购买的双黄连口服液和制备的双黄连口服液整体药效最好,在其他各拆方和单味药中连翘表现出相对较好的体内抗RSV的效果。体外抗病毒和抑菌实验结果显示:购买的50批双黄连口服液体外抗RSV效果差别较大,TI值在4-40之间;原型药2倍稀释液体外抑菌效果在60%-95%之间;实验室制备的双黄连制剂复方治疗效果显著,其他拆方和单味药均未表现出较好的体外抗RSV的效果,体外抑菌结果显示双黄连制剂复方以及单味药连翘效果十分显著均达到85%以上。3.灰色关联度和偏最小二乘回归分析结果显示:体外抑菌结果影响显著的成分包括槲皮素、金丝桃苷、连翘苷等物质大多来自于连翘药材,说明双黄连制剂在体外抑制金黄色葡萄球菌生长作用中起主要作用的成分来自连翘,组方中连翘发挥了主要的药效作用。双黄连制剂体外抗RSV的主要化学成分来自金银花,分析结果显示金银花中的咖啡酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸和断氧马钱子苷等成分与抗RSV关联度大,影响显著,组方中发挥主要药效作用的为金银花。采用LS-SVM法分别构建了60批双黄连复方制剂体外抑菌和抗RSV的谱-效关系数学模型,结果显示所构建的数学模型对每批样品的拟合药效结果偏差均在0.35%以内,验证样本的相对偏差均在5%以内。4.蛋白质组学研究发现了38个与该模型以及药物干预密切相关的差异性蛋白,包括Cd81,Oas3,Rock1等这些差异性蛋白主要涉及的信号通路包括免疫系统过程,防御反应过程,花生四烯酸结合过程,Toll样受体结合过程等。代谢组学研究结果显示模型组小鼠肺组织中多种内源性代谢物代谢异常包括:牛磺酸、葡萄糖、氨基酸、甘油磷脂等物质,给药组小鼠中以上多种代谢异常的物质趋于正常,主要涉及TCA循环、氨基酸代谢、甘油磷脂代谢、泛酸和Co A生物合成等代谢通路。结论:1.双黄连复方制剂中含有多种药效成分,体外抑制金黄色葡萄球菌,体内外抗RSV均有显著的治疗作用。2.指纹图谱与药效的相关性分析得出:双黄连制剂体外抑菌起主要作用的成分主要来自连翘,体外抗RSV起主要作用的成分主要来自金银花;该结果量化分析了双黄连组方中主要药效成分及其归属,科学阐释了双黄连组方的配伍规律,为复方中药配伍及组分新药研究提供了新的思路和方法。3.双黄连制剂复方构建的数学模型不仅可以单纯根据指纹图谱信息对药物进行质量评价,而且能够做到根据指纹图谱预测药效结果,可以为双黄连口服液谱效相关质量综合评价体系的建立提供基础,进一步实现药物评价的全面性、合理性和准确性。4.多组学联合实验发现双黄连复方制剂治疗RSV感染的小鼠模型作用靶点与炎症过程和免疫过程密切相关;小鼠在感染RSV以后机体多种内源性物质发生代谢紊乱,包括牛磺酸、苯丙氨酸、葡萄糖、甘油磷脂等;双黄连复方制剂能够在氨基酸代谢、甘油磷脂代谢TCA循环等多个代谢通路上对RSV感染引起的代谢紊乱进行一定的正向调节作用,使机体紊乱的代谢水平逐步恢复正常,为中药复方作用机制研究提供了新的思路和方法。