论文部分内容阅读
背景:过继性免疫疗法（adoptive cell therapy,ACT）是近年来新兴的肿瘤免疫疗法,是指从肿瘤患者或者健康人志愿者体内分离出肿瘤抗原特异性T细胞,在体外进行筛选和扩增后再回输到肿瘤患者体内的疗法,其对于难治性肿瘤和转移性肿瘤有较好的疗效。ACT疗法分为肿瘤浸润淋巴细胞疗法（tumor infiltration lymphocyte,TIL）,嵌合抗原受体T细胞疗法（chimeric antigen receptor,CAR-T）,T细胞受体基因修饰T细胞疗法（T cell receptor-engineered T cells,TCR-T）等。T细胞的体外扩增培养是决定T细胞状态和功能的关键因素,因此在ACT治疗过程中T细胞扩增培养条件中的优化是目前提高ACT肿瘤免疫治疗的关键所在。目的:通过对比使用两种不同的p38抑制剂Doramapimod和SB202190,以及在临床实验中最常使用的细胞因子IL-2和IL-7+IL-15的培养条件下,检测T细胞在体外培养过程中的扩增能力、T细胞的亚型变化和分泌细胞因子的水平、以及p38抑制剂使用后T细胞对抑制性细胞因子TGF-β的抵抗能力,旨在寻找T细胞体外培养的最优化方案;并在黑色素瘤特异性TCR-T细胞中进行该培养方案的验证,为ACT的临床肿瘤免疫治疗提供新的思路和方法。方法:1、收集健康人志愿者静脉血,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,使用两种p38抑制剂扩增培养T细胞,培养过程中同时分别使用IL-7+IL-15或者IL-2活化T细胞;2、在T细胞扩增培养过程中,通过细胞计数检测T细胞增殖水平;3、T细胞培养10天,采用多色流式细胞术检测CD8+T细胞亚型,根据CD45RA、CCR7的表达将CD8+T细胞亚型分为:初始T细胞（Na（?）ve T cell,TN）、中枢记忆T细胞(Central memory T cell,TCM)、效应记忆T细胞(Effector memory T cell,TEM)和终末分化效应T细胞(Effector memory T cells re-expresses CD45RA,TEMRA),并且检测CD8+T细胞、CD8+TN和CD8+TCM细胞中CD62L的表达水平;采用ELISA检测T细胞IFN-γ和Granzyme-B的分泌水平,并且在TGF-β存在的情况下,检测T细胞上述细胞因子的分泌水平。4、从健康人外周血PBMC中筛选出黑色素瘤肿瘤相关抗原MART-1特异性TCR,构建TCR-T细胞;5、在IL-7+IL-15培养条件下,使用Doramapimod体外培养MART-1TCR-T细胞,并通过临床大量快速扩增（rapid expansion protocol,REP）方法扩增24天,经流式检测CD8+T细胞中CD62L的表达水平;通过特异性抗原肽MART-1刺激TCR-T细胞,采用ELISA检测IFN-γ和Granzyme-B的分泌水平,并且在TGF-β存在的情况下,检测细胞因子的分泌能力。结果:1、使用p38抑制剂处理培养扩增T细胞,在第12天发现两种p38抑制剂均使T细胞数量显著性增加。在IL-7+IL-15和IL-2不同培养条件下均发现同样现象。2、在细胞亚型方面,两种p38抑制剂的处理均可导致CD8+T细胞中TN细胞比例上调,与未处理组比较,其差异具有统计学意义（P<0.01）;在IL-7+IL-15活化培养组中CD8+TN和CD8+TCM细胞CD62L的表达水平上升,而IL-2活化培养组中没有明显增高。3、两种p38抑制剂分别处理后,T细胞IFN-γ和Granzyme-B的分泌水平均明显升高（P<0.001）;在TGF-β存在的情况下,未用p38抑制剂处理的对照组IFN-γ和Granzyme-B的表达明显下降（P<0.001）,而使用p38抑制剂处理后,其IFN-γ和Granzyme-B的分泌较未用p38抑制剂处理组明显升高,其差异具有统计学意义（P<0.001）。4、使用IL-7+IL-15联合Doramapimod抑制剂培养经MART-1 TCR转导的TCR-T,检测发现CD8+TCR-T细胞CD62L的表达水平明显升高（P<0.05）;并且在TGF-β存在,经MART-1特异性抗原肽刺激后,未用Doramapimod处理组IFN-γ、Granzyme-B的分泌明显降低（P<0.001）,而使用p38抑制剂后IFN-γ和Granzyme-B的分泌明显升高,其差异也具有统计学意义（P<0.001）。结论:1、IL-7+IL-15和p38抑制剂的联合处理可有效提高低分化的记忆T细胞比例,这种低分化的记忆T细胞有利于T细胞回输后在体内的长期存活以及更好地发挥T细胞的抗肿瘤作用。2、在TGF-β抑制性细胞因子存在的情况下,p38抑制剂的处理可有效维持T细胞分泌IFN-γ和Granzyme-B的能力,说明在抑制性肿瘤微环境中,p38抑制剂的使用可更好地维持T细胞功能,有效抵抗肿瘤抑制性微环境,这为T细胞体外培养、扩增提供了更优化的培养方案,为临床ACT的肿瘤免疫治疗奠定了较好的基础。