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大黄为大宗药材之一，临床应用广泛。随着中药材需求量的增大，野生大黄资源已经供不应求，主要以栽培为主。蒽醌类成分作为大黄药材质量控制的关键指标，影响其代谢通路及调控合成机制尚不清楚，就无法科学阐明大黄药材品质形成的内在生物学规律。利用现代分子生物学技术解析大黄蒽醌类生物合成通路及表达调控显得更为迫切。高效液相色谱法结合高通量测序对大黄蒽醌类成分以及合成途径分析，为大黄化学成分积累规律、基因功能鉴定、次生代谢途径解析及调控机制研究奠定基础。
本文以药用大黄RheumofficinaleBaill.为研究对象，对采集鲜样进行外观性状分析；高效液相色谱法对一年生、二年生、三年生大黄同一部位以及同一年限根、根茎、叶片三个部位成分进行10种化学成分含量检测；IlluminaHiSeqTM2000150PE高通量测序技术结合生物信息分析大黄一年生生药根、根茎和叶片转录组，揭示差异基因表达特征。研究的主要结果如下：
1.大黄三个生长年限根长、主根直径、根宽、芽数、支根数以及叶片数均随年限增加而增加，平均为两倍左右。三年生主根直径最大为14.4cm，根长最大为37.8cm，根宽最大为39.8cm，支根数、芽数、叶片数分别为13个、5个、14个。
2.本研究以WoburnC18(5μm，4.6mm×250mm)为色谱柱；甲醇(A)和0.2%磷酸水(B)为流动相；设置检测波长为260nm；柱温为30℃；体积流量1.0mL/min；进样体积为10μL。建立高效液相色谱分析体系线性范围良好(R2＞0.997)，没食子酸Y=56320.59X-23043.00，儿茶素Y=15557.01X-2876.04，番泻苷BY=39271.75X+19067.04，大黄酚-8-O-葡萄糖苷Y=25731.75X-14498.35，大黄素-8-O-葡萄糖苷Y=44379.98X-16112.81，芦荟大黄素Y=40316.87X-18836.23，大黄酸Y=37043.21X+14102.39，大黄素Y=23247.39X-7081.04，大黄酚Y=17772.44X+1818.5，大黄素甲醚Y=23247.39X-7081.04。精密度、稳定性、重复性RSD均小于2%，加样回收率96.10%～107.10%。
3.高效液相色谱检测显示10种对照品在所有样品中均差异存在。芦荟大黄素、大黄酸以及大黄酚含量较少，儿茶素积累量最大，各年限根以及三年生根茎中含量达到12mg/g左右。同一部位不同年限或同一年限不同部位的大黄样品中各成分含量存在差异。相同部位没食子酸含量随年限增加明显降低；儿茶素在叶片中的含量降低却在根茎及根中显著增加；结合型蒽醌在一年生以及两年生各部位中成分积累无明显差异，而三年生积累量迅速增加；番泻苷B、五种游离型蒽醌含量都随着年限增加而增加。相同年限可以看出各成分根中积累最多，叶片中最小，尤其儿茶素以及两个结合型蒽醌较为显著；一年生、二年生、三年生芦荟大黄素根茎中含量均高于根与叶片，而大黄素甲醚则根茎中积累最少，根与叶片相当。其余各成分均为根>根茎>叶片。
4.借助IlluminaHiSeqTM2000150PE平台对大黄进行高通量测序，叶片、根、根茎分别有66027560、69133692、55947290条高质量读长，共9.72G、10.22G、8.28Gcleanbases，Trinity组装共得到153203个unigenes，113391000个核苷酸数目，最长为12465nt，最短为201nt，平均长度为1485bp；BLAST分析显示所有unigenes均NR、NT、Swiss-port、PFAM、KOG等数据库中得到注释；GO分类主要归为3个一级分类以及57个二级分类。
LvsR，RvsRH，LvsRH上调表达的差异基因分别为2347个、434个、2488个，下调表达的差异基因分别为2092个、259个、1984个；KEGG分析分为五大分支，其中有2002条unigenes参与17个次生代谢标准通路并在三个部位差异富集。蒽醌类生物合成相关的MVA、MEP、莽草酸及聚酮途径中关键酶基因条数分别为47、46、91、16条。其中，HMGS、DXR、CHS、PKSШ表达量为根茎>根>叶片，PMK、IPPs、SDH表达量均为根>根茎>叶片，其余关键酶均为叶片中表达量最多。169条CYP450基因以及132条糖基转移酶基因(UGTs)可能参与次生代谢物的修饰并差异表达，bHLH、MYB、WRKY、bZIP、GRAS、NAC、MADS等七个转录因子在三个部位中表达差异。MISA分析发现转录组包含227494355个SSRs。
本文以药用大黄RheumofficinaleBaill.为研究对象，对采集鲜样进行外观性状分析；高效液相色谱法对一年生、二年生、三年生大黄同一部位以及同一年限根、根茎、叶片三个部位成分进行10种化学成分含量检测；IlluminaHiSeqTM2000150PE高通量测序技术结合生物信息分析大黄一年生生药根、根茎和叶片转录组，揭示差异基因表达特征。研究的主要结果如下：
1.大黄三个生长年限根长、主根直径、根宽、芽数、支根数以及叶片数均随年限增加而增加，平均为两倍左右。三年生主根直径最大为14.4cm，根长最大为37.8cm，根宽最大为39.8cm，支根数、芽数、叶片数分别为13个、5个、14个。
2.本研究以WoburnC18(5μm，4.6mm×250mm)为色谱柱；甲醇(A)和0.2%磷酸水(B)为流动相；设置检测波长为260nm；柱温为30℃；体积流量1.0mL/min；进样体积为10μL。建立高效液相色谱分析体系线性范围良好(R2＞0.997)，没食子酸Y=56320.59X-23043.00，儿茶素Y=15557.01X-2876.04，番泻苷BY=39271.75X+19067.04，大黄酚-8-O-葡萄糖苷Y=25731.75X-14498.35，大黄素-8-O-葡萄糖苷Y=44379.98X-16112.81，芦荟大黄素Y=40316.87X-18836.23，大黄酸Y=37043.21X+14102.39，大黄素Y=23247.39X-7081.04，大黄酚Y=17772.44X+1818.5，大黄素甲醚Y=23247.39X-7081.04。精密度、稳定性、重复性RSD均小于2%，加样回收率96.10%～107.10%。
3.高效液相色谱检测显示10种对照品在所有样品中均差异存在。芦荟大黄素、大黄酸以及大黄酚含量较少，儿茶素积累量最大，各年限根以及三年生根茎中含量达到12mg/g左右。同一部位不同年限或同一年限不同部位的大黄样品中各成分含量存在差异。相同部位没食子酸含量随年限增加明显降低；儿茶素在叶片中的含量降低却在根茎及根中显著增加；结合型蒽醌在一年生以及两年生各部位中成分积累无明显差异，而三年生积累量迅速增加；番泻苷B、五种游离型蒽醌含量都随着年限增加而增加。相同年限可以看出各成分根中积累最多，叶片中最小，尤其儿茶素以及两个结合型蒽醌较为显著；一年生、二年生、三年生芦荟大黄素根茎中含量均高于根与叶片，而大黄素甲醚则根茎中积累最少，根与叶片相当。其余各成分均为根>根茎>叶片。
4.借助IlluminaHiSeqTM2000150PE平台对大黄进行高通量测序，叶片、根、根茎分别有66027560、69133692、55947290条高质量读长，共9.72G、10.22G、8.28Gcleanbases，Trinity组装共得到153203个unigenes，113391000个核苷酸数目，最长为12465nt，最短为201nt，平均长度为1485bp；BLAST分析显示所有unigenes均NR、NT、Swiss-port、PFAM、KOG等数据库中得到注释；GO分类主要归为3个一级分类以及57个二级分类。
LvsR，RvsRH，LvsRH上调表达的差异基因分别为2347个、434个、2488个，下调表达的差异基因分别为2092个、259个、1984个；KEGG分析分为五大分支，其中有2002条unigenes参与17个次生代谢标准通路并在三个部位差异富集。蒽醌类生物合成相关的MVA、MEP、莽草酸及聚酮途径中关键酶基因条数分别为47、46、91、16条。其中，HMGS、DXR、CHS、PKSШ表达量为根茎>根>叶片，PMK、IPPs、SDH表达量均为根>根茎>叶片，其余关键酶均为叶片中表达量最多。169条CYP450基因以及132条糖基转移酶基因(UGTs)可能参与次生代谢物的修饰并差异表达，bHLH、MYB、WRKY、bZIP、GRAS、NAC、MADS等七个转录因子在三个部位中表达差异。MISA分析发现转录组包含227494355个SSRs。