论文部分内容阅读
巨型艾美耳球虫（Eimeria maxima）隶属于顶复器门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoasida）、真球虫目（Eucoccidiorida）、艾美耳科（Eimeriidae）、艾美耳属（Eimeria）,是9种鸡球虫之一,也是集约化养鸡场最常见且对鸡危害较大的虫种之一,呈世界性分布,我国已有25个省（市、区）报道存在。巨型艾美耳球虫免疫原性强,是组成鸡球虫疫苗的重要种类。国内外已建立了柔嫩艾美耳球虫（E. tenella）、堆形艾美耳球虫（E. acervulina）不同发育阶段的cDNA文库,从文库中筛选了多种重要抗原基因,为研究球虫的分子疫苗和探索基因功能奠定了基础。本文采用实验室单卵囊分离并经鉴定为巨型艾美耳球虫的孢子化卵囊构建cDNA表达文库,采用2种方法进行文库筛选,为寻找抗原基因和研制基因疫苗提供条件。首先,对实验室保存的单卵囊分离物进行种类鉴定。用单卵囊分离物感染2周龄雏鸡,经检测其潜伏期为144 h,主要寄生于小肠中段;收集卵囊培养,其最短孢子化时间为23 h;观测100个孢子化卵囊,呈卵圆形,有极粒,无卵囊残体,未见卵膜孔和极帽,其长宽范围为21.25～37.25μm×16.50～28.00μm,形状指数1.28;检测100个孢子囊,有斯氏体,无孢子囊残体,长宽范围为15.00～17.50μm×7.50～10.50μm。对照国内外文献,鉴定为巨型艾美耳球虫（编号为CAAS 2111130303）。其次,构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库。将巨型艾美耳球虫孢子化卵囊经漂浮法去除杂质,提取总RNA,其OD260/OD280值为1.9;经琼脂糖凝胶电泳,样品的28 S和18 S条带清晰;以总RNA为模板、λTriplex2TM为载体,利用SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建全长cDNA文库,其原始文库容量为1×106 pfu/mL,扩增后的文库滴度为5×1010 pfu/mL,重组率为95%,插入片断主要集中在0.5～1 Kb之间;根据已知序列设计引物,从文库中扩增出编码巨型艾美耳球虫免疫球蛋白重链结合蛋白的基因序列片段,表明所建文库质量好。第三,巨型艾美耳球虫cDNA文库筛选。对所构建的cDNA文库进行了2种途径筛选获得EST序列。1)免疫筛选,用孢子化卵囊可溶性蛋白免疫兔子,获得抗血清,以抗体为探针,对整个文库进行筛选,获得一段EST序列,经BLASTn比对确认为巨型艾美耳球虫核糖体小亚基RNA基因序列;2)直接将λTriplEx2噬菌体文库转化为pTripIEx2文库,获得15条EST序列。2种方法都获得该种球虫的EST序列,证明所建文库可靠。