目的:纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1）是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中重要的一员。内源性PAI-1主要的生理作用是快速抑制组织型纤溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶型纤溶酶原激活物（u-PA）,不仅与血栓形成和纤维化有关,而且与胰岛素抵抗和代谢综合征相关。研究显示,PAI-1在肥胖的人和小鼠的白色脂肪组织（WAT）中表达很高,而其他组织,比如心脏、肾脏、肝脏、骨骼肌等表达都相对较低。因此,提示肥胖的人和小鼠的WAT是PAI-1的主要来源。最新研究揭示,PAI-1的高度表达引起个体脂肪的累积,而PAI-1基因敲除后,个体体重的增加会大大减慢,即使是在高脂饮食（High fat diet,HFD）饲喂的情况下,体重增加也不明显。另外,在HFD饲喂的情况下,白色脂肪细胞出现肥大和增生,而PAI-1基因敲除后,脂肪细胞形态变得更小,提示PAI-1可能是引起肥胖的原因。另外,在HFD饲喂的情况下,正常小鼠的代谢出现了紊乱,而PAI-1基因敲除小鼠在同样的条件下饲喂,代谢则处于正常状态。因此,提示PAI-1可能是参与了WAT的功能与代谢。肥胖者PAI-1过度表达的机制很复杂,目前尚不清楚,有待进一步研究和阐释。巨噬细胞（Macrophage）根据功能和激活状态的差别可分为M1型即经典活化的巨噬细胞（Classically activated macrophage）和M2型即替代活化的巨噬细胞（Alternatively activated macrophage）两种亚型。M1型巨噬细胞主要参与促炎症反应,M2型巨噬细胞主要是起抗炎作用。研究发现,在精瘦的小鼠的WAT中,M2型巨噬细胞多于M1型巨噬细胞,抗炎作用大于促炎作用,所以小鼠的WAT代谢处于正常状态;与此相反,肥胖小鼠的WAT中,M1型巨噬细胞的比例显著增加,多于M2型巨噬细胞,从而打破M1和M2型巨噬细胞的比例平衡,促炎作用大于抗炎作用,小鼠的WAT代谢处于紊乱状态。最新研究揭示,肥胖个体的WAT中,巨噬细胞浸润增加,这些巨噬细胞分散在白色脂肪细胞周围,组成形似“王冠”状的结构,而正是这些“王冠”结构导致了WAT功能紊乱和代谢失调。PAI-1与巨噬细胞浸润均能加重WAT功能紊乱和代谢失调,那两者是否有一定关系呢?另外,提到葡萄糖代谢,就绕不开葡萄糖转运蛋白（Glucose transporter,GLUT）。顾名思义,其功能主要与葡萄糖转运有关。其中葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）主要存在于脂肪细胞中,主管脂肪细胞的葡萄糖转运。有研究发现,低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（Low density lipoprotein receptor-related protein-1,LRP-1）可介导脂肪细胞GLUT4,从而影响脂肪细胞的葡萄糖转运。那么PAI-1是否和这个过程有关系呢?因此,本研究将从PAI-1影响脂肪组织巨噬细胞极性、浸润和脂肪组织LRP-1和GLUT4表达的视角研究PAI-1加重WAT功能紊乱和代谢失调的机制,进一步查明PAI-1与巨噬细胞和LRP-1之间的关系,为临床预防、诊断和治疗代谢类疾病提供新的治疗靶点及理论依据。方法:1.实验准备:繁殖和鉴定C57/BL6小鼠和Pai-1^-/-小鼠,挑选两种同龄雄性小鼠,每组9只。2.建立糖尿病小鼠模型:以HFD饲喂C57/BL6小鼠,连续喂养14周左右,此组记作HFD-WT小鼠。同时,以正常饮食（ND）饲喂C57/BL6小鼠,此组记作ND-WT小鼠;以HFD饲喂Pai-1^-/-小鼠,此组记作HFD-Pai-1^-/-小鼠;以ND饲喂Pai-1^-/-小鼠,此组记作ND-Pai-1^-/-小鼠;相同条件下饲喂14周左右,每周固定时间测定这4组小鼠的体重和血糖值。3.q RT-PCR检测PAI-1和LRP-1 m RNA表达:ND-WT小鼠,HFD-WT小鼠,ND-Pai-1^-/-小鼠,HFD-Pai-1^-/-小鼠这4组分别取其附睾脂肪垫（e WAT）,放入事先准备好的无酶研磨管中,使用组织细胞破碎仪研磨组织15sec,静置数分钟,使其细胞充分破裂,参照提取总RNA的实验步骤提取e WAT的总RNA,运用总RNA琼脂糖电泳实验检测总RNA的质量,然后进行逆转录实验,将总RNA逆转录为c DNA。最后利用q RT-PCR仪分析其目的基因PAI-1和LRP-1 m RNA的表达量。4.PAI-1抑制剂的应用:PAI-039是PAI-1的一种小分子抑制剂。配制PAI-039溶液:每只小鼠PAI-039的剂量为2 mg/kg/day,以无菌水为溶剂,包含0.5%甲基纤维素和2%吐温80。PAI-039处理HFD-WT小鼠,挑选血糖值已达标的HFD-WT小鼠,每天固定时间灌胃,持续30天,此组记作HFD-WT+PAI-039小鼠。加上之前的ND-WT小鼠、HFD-WT小鼠、ND-Pai-1^-/-小鼠和HFD-Pai-1^-/-小鼠这4组,一共5组小鼠,灌胃的30天内定期测定其体重和血糖值。5.测定血脂指标:取ND-WT小鼠、HFD-WT小鼠、ND-Pai-1^-/-小鼠、HFD-Pai-1^-/-小鼠和HFD-WT+PAI-039小鼠这5组,使用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠,采集小鼠下腔静脉血,离心获得血清,测定5组小鼠血脂指标。6.组织学检查:ND-WT小鼠、HFD-WT小鼠、ND-Pai-1^-/-小鼠、HFD-Pai-1^-/-小鼠和HFD-WT+PAI-039小鼠这5组在采集下腔静脉血之后,取其e WAT,用4%多聚甲醛（w/v）固定,石蜡包埋,制成病理切片,做HE染色实验,用显微镜观察脂肪细胞大小和形态并采集图像。免疫荧光实验:ND-WT小鼠、HFD-WT小鼠、ND-Pai-1^-/-小鼠、HFD-Pai-1^-/-小鼠和HFD-WT+PAI-039小鼠这5组在采集下腔静脉血之后,取其e WAT,用4%多聚甲醛（w/v）固定,石蜡包埋,制成病理切片,用anti-F4/80,标记巨噬细胞,对荧光标记进行统计分析,分析巨噬细胞表达。7.糖耐量试验（GTT）:分别挑选ND-WT小鼠、HFD-WT小鼠、ND-Pai-1^-/-小鼠、HFD-Pai-1^-/-小鼠和HFD-WT+PAI-039小鼠这5组,禁食过夜,次日早晨所有小鼠腹腔注射D-（+）-葡萄糖,每只剂量为2 g/kg,分别测定0、30、60、90和120 min这5个时刻的血糖值。胰岛素耐量试验（ITT）:分别挑选ND-WT小鼠、HFD-WT小鼠、ND-Pai-1^-/-小鼠、HFD-Pai-1^-/-小鼠和HFD-WT+PAI-039小鼠这5组,禁食6小时,所有小鼠腹腔注射胰岛素,每只小鼠剂量为0.75 U/kg,分别测定0、30、60、90和120 min这5个时刻的血糖值。8.q RT-PCR检测巨噬细胞相关基因表达:分别取ND-WT小鼠、HFD-WT小鼠、ND-Pai-1^-/-小鼠、HFD-Pai-1^-/-小鼠和HFD-WT+PAI-039小鼠这5组的e WAT,按照提取总RNA的实验方法对组织进行提取,通过琼脂糖电泳实验检测总RNA的质量,利用q RT-PCR仪分析其目的基因（TNF-α、CD11c、MCP-1、IL-1β、CD206、IL-10、Fn1、TGF-β1 m RNA）的表达量。9.统计方法:采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.HFD-WT小鼠喂养14周后,小鼠随机血糖大于11.1mmol/L;HFD-WT小鼠和ND-WT小鼠喂养14周后,前者体重增加明显大于后者,后者只有轻微的增加。2.HFD-WT小鼠喂养14周后,WAT与棕色脂肪组织（BAT）比较,前者PAI-1 m RNA水平显著增加。3.HFD-WT+PAI-039小鼠处理30天后,体重显著降低。4.HFD诱导白色脂肪细胞出现肥大,PAI-1基因敲除和PAI-039处理后,白色脂肪细胞形态变得更小。5.HFD诱导WAT代谢紊乱,PAI-1基因敲除和PAI-039处理后,WAT代谢改善。6.HFD诱导WT小鼠出现胰岛素抵抗,PAI-1基因敲除和PAI-039处理后,小鼠胰岛素敏感性增加。7.HFD诱导WAT中巨噬细胞浸润增加,PAI-1基因敲除和PAI-039处理后,WAT中巨噬细胞浸润减少。8.HFD诱导M1型巨噬细胞标志基因表达增加,PAI-1基因敲除和PAI-039处理后,M1相关基因表达显著降低,M2型巨噬细胞相关标志基因表达增加。9.在ND情况下,WT和Pai-1^-/-小鼠脂肪组织中LRP-1表达无明显差异;在HFD情况下,WT和Pai-1^-/-小鼠相比,后者WAT中LRP-1表达显著降低。结论:综上所述,本研究结果表明PAI-1可能参与脂肪组织局部炎症的发展和葡萄糖转运过程,在调节HFD诱导的肥胖和代谢紊乱方面发挥重要作用。