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研究背景和研究目的邻苯二甲酸酯(PAEs)作为聚氯乙烯塑料的增塑剂,在塑料生产和生活使用过程中释放进入环境,在多种环境介质中均能检出,作为一类环境内分泌干扰物,其对水生生物和藻类的繁殖和生长发育都造成了不同程度的影响。本研究利用秀丽隐杆线虫研究PAEs的雌性生殖毒性,寻找评价PAEs生殖毒性的敏感指标,探讨PAEs对卵子发生过程的损伤作用,探讨其发挥生殖毒性作用的机制。方法和结果一. PAEs对秀丽隐杆线虫的生殖毒性作用1.PAEs对秀丽隐杆线虫繁殖力的影响测定PAEs对线虫的急性毒性,每个试验暴露组选择同步化L4期后24h的N2线虫,设五个染毒剂量组(100、10、1、0.1、0.01mg/L)、溶剂对照组和空白对照组,24孔板染毒暴露24h,染毒结束后观测各个组线虫死亡数,计算PAEs对线虫的LCso。试验结果显示PAEs的LCso远高于100 mg/L,各个剂量组线虫死亡数与溶剂对照组比较均无统计学差异；应用后代数目和世代时间评价PAEs对线虫生育力的影响,每个试验暴露组选择同步化L4期后24h的N2线虫,设三个染毒剂量(10、1、0.1mg/L)、溶剂对照组和空白对照组,24孔板染毒暴露24h,染毒结束后计数线虫后代数目和测定线虫世代时间。结果显示仅DEHP的高剂量染毒组的后代数目与溶剂对照组比较有统计学差异的减少,其他染毒物的各个剂量组均未出现明显变化；PAEs的各个染毒剂量暴露后,世代时间均末出现有统计学差异的延长或缩短。2. PAEs对秀丽隐杆线虫卵子发生的影响应用生殖细胞数目评价PAEs对线虫卵子发生的影响,每个试验暴露组选择同步化L4期后24h的N2线虫,染毒剂量和暴露方式同上,染毒结束后DAPI染色。结果显示,DEHP、DBP和DIBP的中高剂量组的生殖细胞数与溶剂对照组比较均出现了有统计学差异的减少,各个染毒物低剂量组均未出现有统计学差异的改变；JK2868突变株(Plag-2::GFP)的性腺DTC细胞荧光强度反映性腺结构是否正常,每个试验暴露组为同步化L4期后24h的JK2868突变株线虫,染毒剂量和暴露方式同上,染毒结束后检测DTC细胞荧光强度,荧光分析结果提示PAEs染毒暴露后DTC荧光强度未发生改变,提示PAEs不通过影响性腺结构来发挥生殖毒作用。二、PAEs影响秀丽隐杆线虫卵子发生的作用机制1.PAEs对秀丽隐杆线虫生殖细胞凋亡影响计数凋亡的生殖细胞数反映PAEs对线虫凋亡的影响,每个试验暴露组MD701突变株(Plim-7::ced-1::gfp)线虫的染毒剂量和暴露方式同上,染毒结束后,荧光显微镜下检测线虫生殖细胞的凋亡数,试验结果显示PAEs使线虫凋亡水平上升,各个毒物的中高剂量组凋亡细胞数与溶剂对照组比较均有统计学差异；WS1433突变株(HUS-1::GFP)指示线虫生殖细胞DNA损伤诱导的凋亡,每个试验暴露组选择同步化L4期后24h的WS1433突变株线虫,染毒剂量和暴露方式同上,染毒结束后,在荧光显微镜下显示PAEs高剂量染毒组中,线虫生殖细胞DNA修复指示荧光明显增强,提示PAEs暴露后线虫生殖细胞出现DNA损伤诱导的凋亡。2. PAEs对秀丽隐杆线虫生殖细胞凋亡作用机制研究检测凋亡相关基因的表达水平,反映其在凋亡通路中的作用,每个试验暴露组选择80-100μL同步化L4期后24h的N2线虫,染毒剂量和暴露方式同上,染毒结束后提取线虫总RNA, RT-qPCR检测线虫组织中凋亡发生相关基因egl-1、cep-1、ced-9、ced-4和ced-3基因的表达水平,结果显示egl-1、cep-1、ced-4和ced-3基因表达水平明显升高,ced-9基因表达水平显著下降；应用凋亡基因突变株验证凋亡基因在通路中的作用,凋亡相关基因egl-1、cep-1、ced-9、ced-4和ced-3敲除突变株染毒剂量和暴露方式同上,染毒结束后测定PAEs染毒暴露后生殖细胞凋亡数目,试验结果显示egl-1、cep-1、ced-4和 ced-3突变株染毒后凋亡数目明显下降,ced-9突变株染毒后凋亡数目明显增加。三PAEs对秀丽隐杆线虫氧化应激的影响1.PAEs对秀丽隐杆线虫氧化应激的影响测定线虫体内ROS反映线虫氧化应激水平,CM-H2DCFDA探针指示线虫体内产生的ROS,每个试验暴露组选择同步化L4期后24h的N2线虫,染毒剂量和暴露方式同上,染毒结束后,用CM-H2DCFDA探针测定线虫体内ROS水平,荧光显微镜下探针结果显示,PAEs的中高剂量组线虫体内ROS水平均上升；测定ROS中主要成分H2O2水平,每个试验暴露组选择80-100μL同步化L4期后24h的N2线虫,染毒剂量和暴露方式同上,染毒结束后研磨线虫,测定线虫体内H2O2水平,试验结果显示各个剂量组H2O2水平无差异性改变。2. PAEs对秀丽隐杆线虫氧化应激机制研究检测氧化应激相关基因的表达水平,反映其在氧化应激通路中的作用,每个试验暴露组选择80-100μL同步化L4期后24h的N2线虫,染毒剂量和暴露方式同上,染毒结束后提取线虫总RNA, RT-qPCR检测线虫组织中凋亡发生相关基因mev-1、gas-1、isp-1、clk-2基因的表达水平,结果显示isp-1、clk-2基因表达水平明显升高,mev-1、gas-1基因表达水平显著下降。3. PAEs对秀丽隐杆线虫生殖细胞DNA损伤研究应用线虫DNAAP位点数反映DNA损伤情况,每个试验暴露组选择80-100μL同步化L4期后24h的N2线虫,染毒剂量和暴露方式同上,染毒结束后提取线虫DNA,测定线虫DNAAP位点数,结果显示PAEs的不同染毒暴露组的AP位点数随染毒剂量增加而增加,DEHP的中高剂量组以及DBP、DIBP各个剂量组与溶剂对照组比较均有统计学差异。结论PAEs属于低毒性物质,后代数目和世代时间不是评价PAEs对秀丽隐杆线虫生殖毒性的敏感指标,染毒暴露后卵子数目的改变相对后代数目和世代时间更敏感。PAEs通过诱导线虫体内ROS水平增加、产生AP位点数增加的DNA损伤,出现DNA损伤诱导的生殖细胞凋亡及生殖细胞数减少而产生生殖毒性作用。