细胞衰老是一种不可逆转的细胞周期阻滞,衰老的细胞其形态,代谢和分泌表型(SASP)等发生改变。衰老细胞的特点包括体积变大,外观扁平,衰老相关p半乳糖苷酶染色呈阳性,DNA损伤焦点形成等。端粒功能失常,DNA损伤,或氧化应激等均可导致细胞衰老,另外,癌基因的激活也可促进细胞衰老。细胞衰老是防御细胞恶性转化的一种机制。目前研究还发现细胞衰老与胚胎发育、组织修复、促进器官和个体老化有关,如骨关节炎、肺纤维化、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病患者受损组织中,也具有衰老特征的细胞。因此,明确细胞衰老发生的机制对于肿瘤治疗以及缓解机体老化具有重要意义。细胞衰老的发生主要依赖于p53和p16-pRb两种途径,p53主要通过激活其下游靶基因诱导细胞衰老,p16则是通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶而起作用。当细胞经历DNA损伤、癌基因激活和氧化应激等因素刺激时,p53被激活进而调控细胞周期,氧化还原和新陈代谢等相关基因。转录因子p53在这些刺激因素下也可诱导细胞衰老。p53激活可以通过调节靶基因如p21,PML,CXCR2,PAI-1和E2F7等抑制细胞的增殖并诱导细胞衰老,这在抗肿瘤过程中发挥重要作用。但p53过度活化也会导致早老症的发生,MDM2突变的病人,由于MDM2突变丧失了对p53活性的调节,从而使p53稳定表达,这种病人即伴有早衰的症状。MDM2由p53转录激活,反过来,MDM2又可作为p53的一个E3泛素酶,促进p53的泛素化和降解,因此MDM2与p53之间形成了一个自调节反馈环。很多文献也报道了在肿瘤发生中,MDM2调控着其他多种蛋白质的泛素化和降解,并发挥重要的作用。已知的MDM2多泛素化和单泛素化底物还包括FOXO3A,DHFR,SNAIL和H2A。这些底物参与了不同的生物过程,如细胞周期,新陈代谢,氧化还原,上皮间质转化和表观遗传调控等。p53激活诱导细胞衰老的通路主要包括以下几种:p53-ROS,p53-PML,p53-CXCR2和p53-p21。激活p53-ROS正反馈环诱导细胞衰老。p53可以通过调控PML基因促进细胞周期阻滞并诱导细胞衰老。p53转录激活CXCR2诱导细胞衰老。当细胞缺乏PML,p21或者CXCR2时,p53激活诱导的细胞衰老则减少。尽管p53激活可以诱导细胞衰老,但只有少数p53激活诱导细胞衰老的通路被证实,因此p53激活诱导细胞衰老的分子机制仍然是不完整的。我们在本论文中证明了p53激活能下调EGFR并诱导细胞的衰老。表皮生长因子受体(EGFR)在多种肿瘤中过度表达或激活,EGFR异常与许多肿瘤的发生和不良预后相关。研究发现在乳腺癌、肺癌、前列腺癌中EGFR基因以扩增或突变的形式存在,EGFR的异常表达影响了下游信号,最终导致细胞凋亡受损、增殖能力增强、血管生成、坏死以及耐药性的产生。因此,EGFR也是肿瘤治疗的重要靶点,有研究报道EGFR受p53转录调控。鉴于p53能影响EGFR的表达,本文主要探讨p53是否通过调控EGFR而影响压力诱导的细胞衰老,本论文主要分四部分。第一部分EGFR下调介导p53激活诱导的细胞衰老Nutlin-3a(以下简称Nut3a)是MDM2的小分子拮抗剂,它能阻止MDM2与p53的结合,从而抑制MDM2对p53的泛素化和降解,并激活p53通路。我们的研究发现在胶质瘤细胞U87和A172,以及肉瘤细胞U20S和HT1080中,Nut3a激活p53均能诱导这些细胞衰老,同时也可降低EGFR的蛋白水平。为了证明是EGFR的下调介导了 p53激活诱导的细胞衰老,我们用EGFR的抑制剂或其小干扰RNA敲低EGFR,发现同样可诱导肿瘤细胞的衰老,而通过过表达EGFR则抑制了由p53激活诱导的细胞衰老,表明EGFR的下调确实介导了 p53激活诱导的细胞衰老。我们还发现小檗碱诱导的细胞衰老也是由EGFR通路下调介导的。在检测p53激活对EGFR转录水平影响的研究中,我们发现在U87,HT1080,A172细胞中EGFR转录下调,而在U20S细胞中转录却是上调的。尽管p53激活抑制EGFR转录可能导致EGFR蛋白水平的下调,但是在U20S细胞中,EGFR蛋白水平降低的同时,EGFR转录水平却是升高的。这些结果表明,转录后调控可能在EGFR的表达上起着重要的作用,并且p53对EGFR的调控可能具有细胞特异性。第二部分p53通过负调控DYRKIA下调EGFR的蛋白水平在U20S细胞中,p53激活能降低EGFR的蛋白水平,但是其转录水平却是上调的,这表明p53可能会降低EGFR的稳定性。据报道,DYRKIA是维持EGFR稳定性的关键激酶,抑制DYRK1A能降低EGFR的稳定性,促进EGFR的降解,同时还可抑制EGFR依赖的胶质母细胞瘤的增殖。而另一篇文献报道p53可通过miR-1246下调DYRK1A。因此,我们决定检测DYRK1A是否参与p53负调控EGFR的过程。我们研究发现,RNAi抑制DYRK1A表达或者DYRK1A抑制剂Harmine均能明显降低EGFR的蛋白水平。同样,DYRKIA的抑制剂或其小干扰RNA敲低DYRK1A也能诱导肿瘤细胞衰老。重要的是,p53负调控DYRK1A,Nut3a或者p53过表达均能下调DYRK1A的蛋白水平。而p53敲除细胞中,Nut3a下调DYRK1A的作用明显减少,衰老细胞也减少。此外,尽管p53激活能降低DYRK1A和EGFR蛋白水平,但是二者的降低却存在先后顺序,DYRK1A蛋白量的减少发生在EGFR减少之前,提示EGFR蛋白量的减少是DYRK1A下调的结果。此外,DYRKIA过表达能拯救p53激活诱导的细胞衰老,进一步证明了DYRK1A-EGFR的抑制作用介导了 p53激活诱导的细胞衰老。有文献报道,miR-1246是p53的靶基因,p53通过诱导miR-1246表达而下调DYRK1A。但是在我们的研究体系中发现,miR-1246并不能介导p53对DYRK1A的负调控作用。第三部分 MDM2介导p53负调控DYRK1A并促进DYRK1A的泛素化和蛋白降解虽然p53激活可降低DYRK1A的蛋白水平,但是却不影响DYRK1A的转录,而蛋白酶体抑制剂MG132能抑制p53激活诱导的DYRK1A下调,所以此过程有可能是由于蛋白酶体降解引起的。MDM2是p53的靶基因,编码E3泛素连接酶,MDM2主要催化p53的泛素化和降解。我们发现MDM2过表达能降低DYRK1A的蛋白水平,当用RNAi敲低MDM2后,也会减弱p53激活导致的负调控效应。这些结果表明,p53负调控DYRK1A是由MDM2介导的。我们通过转染His-tagged DYRK1A和Myc-tagged MDM2载体来检测MDM2与DYRK1A是否存在物理结合。免疫共沉淀结果显示DYRK1A与MDM2存在相互结合。我们又检测了 MDM2对DYRK1A泛素化的作用,发现野生型MDM2增加了 DYRK1A的泛素化,而突变型的MDM2(C464A)则不能增加其泛素化作用。另外,p53激活也能显著增加DYRK1A的泛素化。而当用RNAi敲低MDM2后,DYRK1A泛素化则减少,这进一步证明了 p53增加DYRK1A的泛素化是通过MDM2介导的。因此,我们发现了 DYRK1A是MDM2新的底物,p53-MDM2通路通过抑制DYRK1A发挥对EGFR的负调控及诱导细胞衰老的作用。第四部分 Nut3a通过下调DYRK1A-EGFR诱导体内胶质母细胞瘤衰老多形性胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的原发性恶性脑瘤,其具有侵袭性和神经破坏性,因此也是人类最致命的癌症之一。有研究证实,在GBM中DYRK1A调控EGFR的稳定性,并且发现DYRK1A在这些肿瘤中高度表达,抑制DYRK1A破坏了它们的生存能力从而抑制肿瘤的增殖。因此,抑制DYRK1A可能是对EGFR依赖性的GBM一种有效的治疗方法。我们研究了 Nut3a激活p53对异种移植脑内神经胶质瘤的影响以及对DYRK1A-EGFR信号通路的调节。体内实验结果表明,Nut3a处理组p53的靶基因p21激活,p53激活后能抑制裸鼠脑内原位肿瘤的生长,同时p53激活降低了DYRK1A和EGFR的蛋白水平并诱导肿瘤细胞衰老,而当EGFR过表达时Nut3a则不能减少肿瘤体积而且p53激活诱导的细胞衰老也减弱。表明体内p53对DYRK1A-EGFR的负调控可以通过诱导细胞衰老抑制肿瘤的生长。由于EGFR在多种肿瘤细胞中高表达,而激活p53又可有效的抑制其表达,所以这一通路为Nut3a作为抗肿瘤药物提供了又一个体内依据。