自从认识到基因组是生物遗传信息的载体,科学家们便对通过改变基因、修饰基因进而理解生物基因的功能产生了极大的兴趣。一代又一代的科学家致力于基因编辑工具的开发与改进,使其变得方便、准确。基因编辑工具的研发极大地促进了生物科学领域的进步。规律成簇间隔短回文重复及其相关系统(CRISPR/Cas)原本是原核生物用来抵抗噬菌体病毒和外源质粒等而存在的获得性免疫系统。受其启发,科学家们开发出的基因编辑与修饰工具CRISPR/Cas9,因其简单方便、易于操作,迅速在科学领域内得到推广,并受到医学界及商界人士的追捧,极力将其推广到临床,用以治疗一些基因遗传或突变引起的疾病。目前,CRISPR/Cas9系统已经在基因编辑、基因表达调控、系统成像等领域得到广泛应用。然而,科学家在进一步提高CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率的同时,也越来越多地关注到该系统的位点特异性研究。本研究的前部分工作研究了 CRISPR/Cas9系统的特异性。本研究采用染色质免疫共沉淀和二代高通量测序(ChIP-seq)的方法,研究了 Cas9蛋白和特异靶向sgRNA在人类细胞基因组中的结合图谱。本研究发现对于不同靶向RNA,Cas9蛋白在人类基因组中具有特异的结合脱靶效应。针对这些脱靶效应位点的进一步生物信息学分析发现,它们大部分都含有保守的与靶向RNA互补的10到12个碱基的种子序列(seed region)和3个碱基的PAM序列(protospacer adjacent motif)。然而令人惊讶的是,体内和体外实验发现对于大部分的脱靶效应位点(除了两个位点外),Cas9虽然结合但并不切割这些脱靶位点。本研究还发现Cas9蛋白的结合脱靶效应具有细胞特异性,提示染色质构象和其他可能的表观遗传因子参与了调控。本研究为进一步解析CRISPR/Cas9基因组编辑的分子机制及优化其在体内和体外的应用提供了重要的工具和方法。本研究的后部分工作成功地构建了各个组织器官中广谱表达dCas9(缺失了酶切活性的Cas9)的SunTag-dCas9小鼠品系。这项研究将用于调节基因表达、表观遗传修饰、活体成像等CRISPR/dCas9系统,从细胞水平的研究扩展到动物水平。SunTag-dCas9小鼠模型将为建立基因表达变化与疾病相关的动物模型,模拟疾病的发生、发展,对于人们理解疾病的发生机理提供极大的帮助。SunTag-dCas9小鼠模型的建立也将为CRISPR/dCas9在动物活体成像领域内的研究提供强有力的工具。本研究构建的SunTag-dCas9小鼠将推动CRISPR/dCas9在这些领域内的快速发展。