论文部分内容阅读
东北刺人参(Oplopanax elatusNakai)属于五加科植物,具有珍贵的药用价值,其生长条件严格,野生资源少,现因人为的过度采挖,导致野生资源日益减少,影响产品的开发利用。利用植物细胞培养技术通过大量培养东北刺人参不定根用于产品开发和生产具有重要意义。研究表明东北刺人参不定根中含有黄酮、多酚和多糖等多种有效活性成分,具有抗氧化、抗炎和抗癌等药理活性,但东北刺人参不定根抑制黑色素方面并没有相关报道。因此,本研究采用生化酶学法和细胞学法探究了东北刺人参不定根对黑色素抑制的影响,旨在为美白化妆品领域提供一种新型植物材料。酪氨酸酶是黑色素形成的关键酶。在生化酶学研究中,以阳性对照曲酸为样品,研究酶促反应条件对酪氨酸酶活性的影响,筛选出最佳的反应条件,即:底物多巴浓度为1mmol·L-1,酪氨酸酶浓度为50U·mL-1,水浴0min,酶与底物反应5min。之后,研究了不同溶剂提取物对酪氨酸酶活性的影响,结果表明乙醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用最强,IC5o为0.39mg·mL-1。利用单因素试验方法研究了提取温度、提取次数、提取时间及料液比对酪氨酸酶活性的影响,进一步利用正交试验方法对提取工艺进行了优化,优化结果显示在提取温度为70 ℃时,提取次数为3次,每次提取1.5 h,料液比为1:20下,不定根乙醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制效果最显著,抑制率达到77.6%。在细胞学试验中,研究了不定根提取物对小鼠黑素瘤细胞(B16-F10)中黑色素含量的影响,并对MAPK和cAMP两种信号通路相关蛋白表达量进行检测,以阐明不定根提取物抑制黑色素形成的机制。结果发现,不定根提取物浓度在12.5至50μg·mL-1范围内对酪氨酸酶活性和黑色素含量均有显著(p<0.01)的抑制作用;在MAPK信号通路中,经不定根提取物处理后,p-p38(p<0.05)和p-JNK(p<0.01)蛋白表达量均明显下降,p-ERK蛋白表达量则显著(p<0.01)增加;对cAMP信号通路相关蛋白的表达量进行检测的结果,用不定根提取物处理后,p-CREB的蛋白表达量显著(p<0.01)降低。进一步对黑色素形成相关的转录因子(MITF)和酪氨酸酶及其相关蛋白酶(TRP-1和TRP-2)进行检测,发现不定根提取物对MITF及酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2的表达量均有显著(p<0.01)的抑制效果。因此,不定根提取物可通过调控MAPK和cAMP信号通路抑制黑色素。