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【研究背景与目的】乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发病的独立高危因素。整合的HBV-DNA基因组编码的乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)是一种重要的反式作用因子,能广泛激活多种原癌基因的转录表达,是肝细胞恶性转化的重要原因。HBx蛋白可干扰癌细胞间的粘附连接,促进细胞外基质降解,诱导肝癌细胞发生上皮间叶表型转化(epithelial-mensenchymal transition,EMT),促进肝细胞癌侵袭转移。上皮钙粘附素(E-cadherin)表达缺失是EMT的重要标志。组织病理和免疫化学染色分析发现,E-cadherin表达缺失的HCC分化程度低,恶性程度高,更易发生肝内转移和门静脉侵犯,E-cadherin的表达缺失与HCC临床预后密切相关。E-cadherin编码基因CDH1的转录沉默是导致其表达缺失重要机制。Snail1蛋白是锌指蛋白Snail超家族的成员,具有强大的EMT诱导能力。借由其羧基末端的锌指结构与CDH1核心启动子区的E-box基序结合,Snail1蛋白能有效遏制后者的转录表达,造成E-cadherin表达缺失,诱导EMT发生。基于以上的研究背景,我们推测:HBx蛋白有可能通过激活肝癌细胞的Snail1编码基因SNAI1转录,上调Snail1蛋白表达,进而诱导肝癌细胞发生EMT,提高其侵袭运动能力。我们希望能够通过本研究明确,在HBx促进肝细胞癌侵袭转移过程中,Snail1蛋白发挥了关键的介导作用,并初步探讨HBx对SNAI1基因的转录调控机制。【材料与方法】一、采用免疫组织化学染色的方法,检测74例肝细胞癌组织标本中HBx、Snail1、E-cadherin、N-cadhe、Vimentin的表达,并分析之间的相关性。收集上述病例的临床病理特征,分析HBx、Snail1表达与HCC临床病理之间的联系。初步明确:1、Snail1蛋白是否与肝细胞癌临床病理分期及恶性程度相关;2、HBx与Snail1表达之间是否存在相关性。二、构建SNAI1基因重组腺病毒表达载体Ad-SNAI1。利用Ad-SNAI1高效感染肝癌细胞株HepG2,诱导外源性Snail1蛋白过表达,观察Snail1蛋白对肝癌细胞株上皮表型及侵袭运动能力的影响。三、利用我所改建并保存的HBx基因重组腺病毒表达载体Ad-HBx感染无HBV感染背景的肝癌细胞株HepG2。观察外源性HBx基因的介入是否能诱导肝癌细胞株内源性Snail1蛋白表达增高,及其对肝癌细胞上皮表型及侵袭运动能力的影响。四、利用RNAi技术沉默肝癌细胞株内源性SNAI1转录表达,观察内源性Snail1表达缺失是否能逆转HBx对肝癌细胞株EMT的诱导。为此,首先设计并筛选出有效的RNA干扰序列,并委托上海吉玛制药技术有限公司合成pGPU6/GFP/Neo-shSNAI1。为了获得高效的转染效率以保证shSNAI1导入HepG2细胞,将pGPU6/GFP/Neo-shSNAI1质粒改造为重组腺病毒载体Ad-shSNAI1。Ad-shSNAI1和Ad-HBx共转染HepG2细胞株,观察细胞表型及侵袭运动能力的改变。五、构建5’端裁剪的SNAI1系列启动子pGL3-Basic报告基因质粒。以海肾荧光素酶质粒(pRL-TK Vector)为内参质粒,转染肝癌细胞株SMMC-7721。比照在共转染空腺病毒载体和Ad-HBx条件下,各启动子区的转录活性,确定HBx蛋白是否能激活SNAI1转录活性,并初步明确其调节区段。【结果】一、74例肝癌组织标本中,58例HBx表达阳性,47例Snail1蛋白表达阳性。45例同时表达HBx、Snail1,两者表达显著相关,p=0.002。HBx表达阳性与E-cadherin表达缺失、N-cadherin表达增强相关,Snail1表达阳性与E-cadherin表达缺失、N-cadherin、Vimentin表达增强相关。结合临床病理特点分析提示:HBx表达阳性与HCC TNM分期、肿瘤大小、门静脉侵犯显著相关,Snail1表达阳性与HCC TNM分期,肿瘤大小、门静脉侵犯、肝周侵犯和外周血HBV-DNA活跃复制相关。提示:Snail1可作为肝细胞癌具有较强侵袭转移能力的分子标志,Snail1的表达增高极有可能与HBV感染有关。二、成功构建SNAI1重组腺病毒载体Ad-SNAI1。Ad-SNAI能高效感染HepG2细胞,SNAI1mRNA和Snail1蛋白表达显著上升。HepG2细胞外源性Snail1蛋白的过表达,造成E-cadherin表达缺失,N-cadhrein、Vimentin表达明显上调;随机运动实验、侵袭实验和趋化运动实验证实,肿瘤细胞运动和侵袭能力显著增强。三、HepG2细胞株转入外源性HBx基因后,HBx蛋白能有效表达。RT-PCR,Western blot检测发现,HBx蛋白能诱导SNAI1 mRNA和Snail1蛋白表达水平明显上调。HepG2细胞E-cadherin表达受到显著抑制,N-cadherin、Vimentin表达上调,肿瘤细胞侵袭运动能力增强。四、成功筛选出针对SNAI1的有效RNAi靶序列,并成功的将hU6-shSNAI1片段克隆至腺病毒载体,改建成Ad-shSNAI1。Ad-shSNAI1感染靶细胞,证实能有效沉默目的基因转录表达。相同方法改建阴性对照载体Ad-shNC。将Ad-shSNAI1与Ad-HBx共转染HepG2细胞株。RT-PCR、Western blot检测证实,与阴性对照相比,RNAi组在mRNA水平和蛋白水平,E-cadherein表达都得以保留,N-cadhrein、Vimentin表达仍维持低水平。肿瘤细胞侵袭运动能力反而出现下降。HBx的促EMT和促侵袭转移能力被有效遏制。五、成功构建了三个5’端缺失、保留共同3’端的SNAI1启动子荧光素酶报告质粒。共转染Ad-HBx后,外源性HBx蛋白能显著增强SNAI1启动子活性。通过系列启动子缺失实验,进一步发现HBx在SNAI1基因启动子区的转录活性调控序列定位于-869~-514 (相对于转录起始位点)。HBx可能通过激活PI3K-Akt通路上调SNAI1启动子转录活性。【结论】一、肝癌组织中,HBx蛋白的表达与Snail1蛋白表达密切相关,二者的阳性表达均与临床肝细胞癌恶性程度高,侵袭能力强相关。二、外源性Snail1过表达可诱导肝癌细胞发生EMT,增强其侵袭能力。HBx蛋白能诱导肝癌细胞内源性Snail1过表达,促进EMT进程。三、干扰肝癌细胞SNAI1基因转录,沉默Snail1蛋白内源性表达,可有效逆转HBx蛋白对肝癌细胞株的EMT诱导,肝癌细胞仍维持上皮表型,侵袭运动能力反而受到抑制。证实Snail1是HBx诱导肝癌细胞EMT的关键中间分子。四、HBx可能通过激活PI3K-Akt通路上调SNAI1启动子转录活性,其调控区段位于-869~-514 (相对于转录起始位点)之间。