腰椎是人体负重、活动的枢纽,呈生理性前凸,椎间盘后薄前厚,随年龄增长,纤维环及髓核的含水量逐渐降低,蛋白黏多糖的量也逐年下降,胶原纤维逐渐溶解,髓核也会失去弹力及膨胀性能,这样就造成在受外力时,腰椎间盘易发生萎缩、弹性减弱等退行性病变,髓核也可能从纤维环薄弱处外突。随着对腰椎间盘退变机制研究的深入,可知导致腰椎间盘退变的因素是多样且复杂的。腰椎间盘结构改变后在力学作用下导致最终的腰椎间盘突出是比较明确的病理过程,但是在腰椎间盘结构改变的过程中也存在许多复杂因素,比如生理化学因素和生物学因素等,前者有研究表明突出的腰椎间盘自发地产生一氧化氮、白细胞介素6和前列腺素E2等;一氧化氮作为炎症介质具有扩血管并抑制白细胞介素6和蛋白多糖合成的作用,而白细胞介素6促进组织金属蛋白酶抑制剂1的表达;后者主要集中于蛋白质组学研究,但是近年来对于腰椎间盘组织的蛋白质组学研究大多集中于胶原蛋白、蛋白多糖和弹性蛋白等,而对于正常和退变腰椎间盘组织整体蛋白质组学的研究报道却较为鲜见。为了深入揭示退变腰椎间盘蛋白质成分改变规律和发生机制,以及为腰椎间盘退行性疾病的生物学治疗提供新途径,本实验采用蛋白质组学的方法,包括双相凝胶电泳和质谱分析鉴定技术,较为系统地对人体正常和退变腰椎间盘组织内的蛋白质组进行研究。第一部分正常和退变腰椎间盘蛋白质的双相电泳图谱目的:建立正常和退变腰椎间盘髓核蛋白质的双相电泳图谱,探讨它们之间的差异。材料及方法:(一)、由自愿者提供的正常和退变腰椎间盘组织各6例,年龄21～45岁,其中男9例,女3例;取材范围L3～L5。(二)、氯化铯梯度离心去除正常和退变腰椎间盘髓核组织蛋白多糖,通过固相pH梯度(IPG)等电聚焦和梯度聚丙烯酰胺双相电泳分离蛋白质,分析电泳图像。结果:正常腰椎间盘与退变腰椎问盘电泳结果存在显著差异,这些蛋白质在pH3～10、相对分子质量16 000～250 000范围内能被很好地分离;正常腰椎间盘蛋白质电泳图谱呈现均匀分布状态,未见明显的蛋白质差异点位;而退变腰椎间盘蛋白质电泳图谱呈现明显的差异分布状态,可见较多的蛋白质差异点位。结论:正常腰椎间盘髓核组织内的蛋白质绝大部分为胶原蛋白,这也是电泳图谱结果呈现均匀分布状态的根本原因;而退变腰椎问盘组织中的胶原蛋白被大量水解破坏而明显减少,同时其他蛋白质的数量增加导致电泳图谱结果呈现明显的差异化分布,这也是接下来进行质谱分析此些差异蛋白的根源所在。第二部分:正常和退变腰椎间盘差异蛋白质的质谱分析目的:鉴定正常和退变腰椎间盘髓核组织之间的差异表达蛋白,明确这些蛋白质的性质。方法:从正常和退变腰椎间盘组织双相电泳图谱的结果中选取差异显著的16个蛋白质位点,使用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪和肽质量指纹谱数据库对这些差异蛋白质点进行分析鉴定。结果:对16个差异显著的蛋白质点进行质谱鉴定,根据检测结果与肽质量指纹谱数据库中现有蛋白质的匹配程度确定所检测点位的蛋白质属性,再根据GPMAW8.00 DEMO蛋白质质谱与序列分析软件分析检索结果中的Protein Score值,得到了统计学上具有显著性差异意义的6种蛋白质。结论:正常和退变腰椎间盘组织在蛋白质组学上确实存在显著差异,质谱分析技术能够有效地鉴定这些差异蛋白质的属性;16个双相电泳差异蛋白质位点中不具有统计学意义的考虑为在髓核当中有很多胶原成分以及蛋白质分解的片段,这些片段无法在肽质量指纹图谱数据库中搜索出在统计学上具有显著性意义的结果。小结:1.在正常腰椎间盘组织中,以Ⅱ型胶原为主的胶原蛋白占据绝大部分,小分子蛋白含量明显较少;在腰椎间盘组织发生退变的过程中,组织中的蛋白质种类和含量发生了明显变化,蛋白多糖和胶原蛋白被大量分解破坏,含量明显减少,而同时其他种类的蛋白质表达增多,甚至产生正常腰椎间盘组织中未有的蛋白质。2.通过以蛋白质电量负荷和相对分子质量为实验原理的双相电泳技术可以有效地分离出正常和退变腰椎间盘髓核组织中的差异蛋白质,而基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪可以很好地鉴定出这些差异蛋白质的性质,为进一步明确这些差异蛋白质的作用机理奠定基础。3.应用双相电泳和质谱分析技术,我们清楚地发现退变腰椎间盘组织的蛋白质组学发生了明显变化,并从中发现了部分统计学上具有显著性差异的蛋白质,为退变腰椎间盘组织蛋白质组学的进一步研究埋下了伏笔,同时为腰椎间盘退变性疾病的生物学预防和治疗提供了更广泛更深刻的可能性。