一、研究背景和目的胃肠动力障碍存在于30%～50%糖尿病患者。平滑肌是胃肠运动的执行者,其损伤必然导致胃肠动力障碍发生。但目前糖尿病结肠平滑肌病变的相关研究甚少。糖基化终末产物(AGEs)参与了糖尿病的众多并发症,且存在于糖尿病大鼠结肠肌层组织,AGEs的标志物Nε-羧甲基赖氨酸(CML)通常用于衡量AGEs水平。糖尿病结肠平滑肌发生了何种病变,且AGEs是否参与平滑肌病变尚无研究报道。平滑肌细胞(SMC)标志性蛋白包括平滑肌肌球蛋白重链(SM MHC)、平滑肌肌动蛋白α (SM α-actin)、钙调结合蛋白(caldesmon)等,这些蛋白是平滑肌收缩功能的基本装置和调节蛋白。AGEs是否为可改变平滑肌收缩蛋白发生变化尚未阐明。因此,本研究首先从形态学上观察糖尿病患者结肠平滑肌超微结构改变；检测肌层组织中AGEs含量以及平滑肌标志蛋白的表达变化,并将标志蛋白表达量与AGEs的含量进行相关性分析,明确糖尿病结肠平滑肌病变及其与AGEs的关系。进一步在动物试验中,探讨AGEs在糖尿病结肠平滑肌病变中的作用。SMC可在“收缩表型”及“合成表型”间相互转换。正常胃肠道中SMC几乎均以“收缩表型”存在。AGES起病变的分子机制,大多与氧化应激、JNK、 p-38 MAPK等相关；平滑肌标志蛋白的表达受Myocardin调控。在细胞实验中,将通过建立体外培养“收缩型”SMC的模型,观察AGEs影响“收缩型”SMC表达标志蛋白的作用及可能机制。二、方法1、糖尿病患者结肠平滑肌病变与糖基化终末产物相关性的临床研究(1)收集2012年8月～2013年1月于江苏省人民医院行结肠手术患者(对照组及糖尿病组)的结肠标本,采集部位距离病变边缘5cm以上(2) Western Blot法检测糖尿病患者结肠肌层AGEs标志物CML含量(3)电镜观察糖尿病患者结肠平滑肌超微结构改变(4) Western Blot法和Real-time PCR法检测糖尿病患者结肠平滑肌标志蛋白及其mRNA表达变化(5) Pearson方法分析糖尿病患者结肠肌层AGEs标志物CML含量与平滑肌标志蛋白表达量的相关性2、糖基化终末产物在糖尿病大鼠结肠动力障碍平滑肌病变中的作用研究(1)采用链脲菌素(STZ)诱导的糖尿病(DM)大鼠模型,给与AG干预。实验分组如下：①正常对照组(Control组)；②正常+AG组(Control+AG组)；③糖尿病组(DM组)；④糖尿病+AG组(DM+AG组)。(2)检测并比较各组大鼠血清及结肠肌层AGEs标志物CML含量(3)检测并比较各组大鼠结肠转运时间及结肠肌条收缩功能(4)观察并比较各组大鼠结肠大体标本情况及结肠肌层病理变化(HE染色)(5) Western Blot及Real-time PCR测定并比较各组大鼠结肠肌层平滑肌标志物表达变化。3、糖基化终末产物促平滑肌细胞标志蛋白表达的机制研究(1)改良培养方法建立体外培养“收缩型”SMC模型,并鉴定。(2)流式细胞术检测AGEs对“收缩型”SMC细胞周期的影响。3) Western Blot及Real-time PCR检测AGEs对“收缩型”SMC标志蛋白表达的浓度效应及时间效应。(4)流式细胞术检测AGEs对“收缩型”SMC合成活性氧自由基(ROS)的作用。(5) Western Blot检测JNK、p38 MAPK信号在AGEs促“收缩型”SMC标志蛋白表达中的作用。(6) siRNA干扰及荧光素酶报告基因的方法来观察Myocardin在AGEs促“收缩型”SMC标志蛋白表达中的作用。三、结果1、糖尿病患者结肠平滑肌病变与糖基化终末产物相关性的临床研究(1)对照组与糖尿病组各纳入病例15例。糖尿病组与对照组相比,患者平均年龄与男女性别构成比均无统计学差异。糖尿病组糖化血红蛋白(HbAlc)水平显著高于对照组。(2)糖尿病组结肠肌层中AGEs标志物CML水平显著高于对照组。(3)糖尿病患者结肠平滑肌出现以下超微结构改变：线粒体肿胀、空泡变性；SMC胞膜上致密斑、胞质内致密体数量增加；SMC细胞膜上腔洞数量明显增加；缝隙连接损伤,连接中断；但SMC间距离并未增宽,细胞间隙中也无过多的胶原纤维填充。(4)糖尿病患者结肠平滑肌标志蛋白SM MHC及SM α-actin mRNA水平较对照组升高；蛋白表达水平与mRNA趋势一致。(5)糖尿病患者结肠肌层AGEs标志物CML含量与平滑肌标志蛋白SM MHC、 SM α-actin mRNA表达量均呈正相关。2、糖基化终末产物在糖尿病大鼠结肠动力障碍平滑肌病变中的作用研究(1)糖尿病大鼠模型成功建立,且AG干预不影响血糖水平。(2)DM组血清及结肠肌层AGEs标志物CML含量均显著升高,DM+AG组CML含量低于DM组,与Control组无差异,且Control组与Control+AG组间CML含量无差异,说明AG可有效抑制AGEs (CML)形成。(3)DM组结肠转运时间延长,肌肉收缩张力下降；DM+AG组结肠转运时间短于DM组、肌肉收缩张力强于DM组,且均与Control组无差异；Control组与Control+AG组间结肠转运时间和肌肉收缩张力无差异。(4)DM组结肠长度增加、肌层均匀增厚,SMC体积增大；DM+AG组未出现上述病理改变,与Control组无差异。Control组与Control+AG组间结肠长度、肌层厚度和SMC体积均无差异。(5)DM组结肠肌层平滑肌标志蛋白SM MHC及SM α-actin表达增加(蛋白及mRNA水平),DM+AG组SM MHC及SM α-actin表达低于DM组,与Control组无差异。Control组与Control+AG组间SM MHC及SM α-actin表达无差异。3、糖基化终末产物促平滑肌细胞标志蛋白表达的机制研究(1)将SMC接种于层粘连蛋白包被的培养皿中,用含低浓度血清(0.25%胎牛血清)和胰岛素的培养基进行培养,可维持SMC的收缩表型。(2) AGEs不改变“收缩型”SMC细胞周期,即不促进“收缩型”SMC增殖。(3) AGEs对“收缩型”SMC标志蛋白表达的作用成浓度、时间依赖性。(4) AGEs并不促进“收缩型”SMC合成ROS。(5) AGEs可激活JNK和p38 MAPK发生磷酸化,但只有p38 MAPK抑制剂(SB239063)可阻断AGEs促“收缩型”SMC标志蛋白表达的作用,JNK(SP600125)不具备该作用。说明AGE促“收缩型”SMC标志蛋白表达的作用通过p38 MAPK完成。(6) ①AGEs促进“收缩型”SMC表达Myocardin, Myocardin siRNA可阻断AGEs促SMC标志蛋白表达的作用。说明Myocardin参与AGEs促“收缩型”SMC标志蛋白表达的作用。②p38 MAPK抑制剂(SB239063)可阻断：AGEs促“收缩型”SMC表达Myocardin的作用；AGEs增强Myocardin启动子活性的作用。说明AGEs促进“收缩型”SMC表达Myocardin通过p38 MAPK完成。四、结论1、糖尿病患者结肠平滑肌存在与收缩相关的超微结构改变,这可能是结肠动力障碍发生的基础。糖尿病患者结肠肌层AGEs含量增加及结肠肌层平滑肌标志蛋白表达增加,且二者具有正相关性,因此AGEs可能参与糖尿病结肠平滑肌病变。2、糖尿病大鼠结肠转运功能及肌肉收缩力下降,并伴有平滑肌细胞体积增大、标志蛋白表达增加的病理改变。AGEs是导致糖尿病大鼠结肠动力功能、肌肉收缩力下降及结肠平滑肌标志蛋白表达增加的上游因素。3、AGEs不引起“收缩型”SMC增殖,也不增加“收缩型”SMC ROS合成。AGEs促进“收缩型”SMC表达标志蛋白,该作用机制可能为激活p38 MAPK磷酸化,增强Myocardin启动子活性,促进Myocardin表达,最终上调平滑肌标志蛋白表达水平。