星形胶质细胞溶酶体介导的β-淀粉样蛋白释放机制的研究

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β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)是阿尔茨海默病发病过程中的最为关键的毒性因子。在病理刺激,例如缺血缺氧、大量的谷氨酸刺激等,星形胶质细胞溶酶体能否将 Aβ释放出细胞外来加重神经元的损害并不清楚。我们将使用活细胞成像的方法结合ELISA等方法研究星形胶质细胞溶酶体释放Aβ的过程,模式以及下游的信号机制。  在本实验中,我们使用 FM1-43染料长时间(2 h)孵育星形胶质细胞来标记溶酶体,使用带有荧光标记的Aβ孵育星形胶质细胞2h定位于溶酶体,通过激光共聚焦显微镜实时观测,我们发现溶酶体内的Aβ在1μM ionomycin刺激下或5 mM谷氨酸刺激下能释放。我们同时使用无荧光标记的Aβ处理星形胶质细胞2 h,之后使用1μM ionomycin和5 mM谷氨酸刺激不同的时间,取细胞培养基,通过ELISA手段检测细胞外Aβ的含量,我们发现随着刺激时间的增加,细胞外 Aβ含量随之增加,因此可以得出结论在病理条件下星形胶质细胞能够将 Aβ释放出细胞外,而且这一过程是钙离子依赖模式,同时具有时间依赖性。我们通过使用荧光淬灭剂溴酚蓝(Bromophenol Blue,BPB)来验证溶酶体与细胞膜融合的方式,在细胞外应用BPB,使用1μM ionomycin刺激时能够引起比不加入BPB更大程度的释放;而先让星形胶质细胞内吞BPB,使用1μM ionomycin刺激时可以引起溶酶体荧光的短暂升高,结果支持溶酶体与细胞膜融合的“kiss and run”观点。通过转染囊泡相关蛋白7(vesicle-associated membrane protein7,Vamp7)缺陷型质粒(Longin-Vamp7),我们发现星形胶质细胞溶酶体释放 Aβ的速率与空白组相比显著降低;而转染囊泡相关蛋白7过表达型质粒(Vamp7)时,我们发现星形胶质细胞溶酶体释放Aβ的速率与空白组相比显著升高,因此星形胶质细胞溶酶体释放Aβ是Vamp7蛋白依赖的。  综合所述,在谷氨酸或其他引起细胞内钙增加的刺激下,星型胶质细胞溶酶体能以“kiss and run”的模式释放Aβ。Vamp7参与星型胶质细胞溶酶体介导的Aβ释放。该研究有利于于我们更好的理解阿尔茨海默病,并为阿尔茨海默病的预防和治疗提供新的思路。
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