论文部分内容阅读
目的1.观察体外循环（cardiopulmonary bypass,CPB）大鼠脑损伤与NLRP3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎性小体的关系。2.探讨 α7 烟碱型乙酰胆碱受体（alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR）激动剂对NLRP3炎性小体以及CPB大鼠脑损伤的影响。方法健康清洁级成年雄性SD大鼠40只,体重350～450g,周龄10～12周,采用随机数字表法将大鼠分为四组,每组10只:假手术组（S组）、CPB组（C组）、α7nAChR激动剂PHA568487+CPB组（CP组）、α7nAChR拮抗剂甲基牛扁亭碱（methyllycaconitine,MLA）+PHA568487+CPB（CPM组）。2%戊巴比妥50mg/kg腹腔注射麻醉后,行气管插管接小动物呼吸机机械通气。大鼠备皮消毒后,左隐动脉穿刺置管监测血压,左大隐静脉穿刺置管输液,肝素400IU//kg静注后,对C组大鼠行右隐动脉联合右颈内静脉穿刺置管,进行CPB 1h;S组穿刺置管后,不进行CPB;CP组在CPB前30min,腹腔注射0.8mg/kg PHA568487,其余处置同C组;CPM组在CPB前45min腹腔注射6mg/kg MLA,其余处置同CP组。所有大鼠术前行Morris水迷宫定位航行训练五天,每天上下午各两次。术后第三天再用Morris水迷宫测试各组大鼠的逃避潜伏期和120s穿越原平台次数。2h后麻醉大鼠,经腔静脉抽血后4℃生理盐水心脏灌洗,随后立即对大鼠断头,取一侧海马-80℃冷冻保存;另一侧取大脑海马组织TUNEL染色计算凋亡指数（apoptotic index,AI）。对冷冻后的海马研磨、取组织匀浆离心。ELISA检测血浆和海马IL-1β和IL-18的浓度、caspase-1试剂盒检测海马caspase-1酶活性、Western blot法检测海马NLRP3、ASC和pro-caspase-1 蛋白表达、RT-PCR法检测海马NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA表达。使用SPSS 19.0软件对数据进行分析,计量资料以均数±标准差（x±s）表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05,P<O.05视为差异有统计学意义。结果1、各组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期和120s穿越原平台次数变化与S组比较,C、CP、CPM组逃避潜伏期均延长、120s穿越原平台次数均减少;与C组比较,CP组的逃避潜伏期缩短、120s穿越原平台次数增加;与CP比较,CPM组的逃避潜伏期延长、120s穿越原平台次数减少（P<0.05）。2、各组大鼠海马神经元凋亡指数的变化与S组比较,C、CP、CPM组的大鼠海马神经元凋亡指数均增加;与C组比较,CP组大鼠海马神经元的凋亡指数减少;与CP组比较,CPM组大鼠海马神经元的凋亡指数增加（P<0.05）。3、各组大鼠血浆和海马IL-1β、IL-18浓度变化与S组比较,C、CP、CPM组的血浆和海马IL-1β和IL-18的含量均增加;与C组相比,CP组的血浆和海马IL-1β和IL-18含量减少;与CP组相比,CPM组的血浆和海马IL-1β和IL-18的含量增加（P<0.05）。4、各组大鼠海马Caspase-1酶活性水平变化与S组比较,C、CP、CPM组海马组织的caspase-1酶活性增加;与C组比较,CP组的酶活性降低;与CP组比较,CPM组的酶活性增加（P<0.05）。5、各组大鼠海马NLRP3、ASC和pro-caspase-1蛋白表达变化以GAPDH为内参,Western blot检测大鼠CPB术后三天海马NLRP3、ASC和pro-caspase-1相对表达量结果显示:与S组比较,C、CP、CPM组的NLRP3、ASC和pro-caspase-1的蛋白表达量增加;与C组比较,CP组的NLRP3、ASC和pro-caspase-1的蛋白表达量减少;与CP组比较,CPM组的NLRP3、ASC和pro-caspase-1的蛋白表达量增加（P<0.05）。6、各组大鼠海马NLRP3、ASC和caspase-1基因表达的变化采用相对定量法2-△△Ct计算各组大鼠海马NLRP3、ASC和caspase-1相对于S组的mRNA表达量。RT-PCR检测大鼠CPB术后三天海马NLRP3、ASC和caspase-1的相对表达量结果显示:与S组比较,C、CP、CPM组大鼠海马NLRP3、ASC和caspase-1 的mRNA表达量增加;与C组比较,CP组大鼠海马NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA表达量减少;与CP组比较,CPM组大鼠海马NLRP3、ASC和caspase-1 的mRNA表达量增加（P<0.05）。结论1、CPB可导致大鼠发生炎症性脑损伤,NLRP3炎性小体参与了此过程并发挥重要作用。2、α7nAChR激动剂PHA568487可通过抑制NLRP3炎性小体,减轻CPB大鼠脑损伤,发挥脑保护作用。